侯玉艷,吳素蕊,張 麗,趙天瑞,*,邰麗梅

(1.昆明理工大學(xué) 云南省食品安全研究院,云南昆明 650500;2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所,云南昆明 650221)

黑脈羊肚菌SOD的純化及特性研究

侯玉艷1,吳素蕊2,張 麗1,趙天瑞1,*,邰麗梅2

(1.昆明理工大學(xué) 云南省食品安全研究院,云南昆明 650500;2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所,云南昆明 650221)

采用熱擊法和硫酸銨分級沉淀法對所提取的黑脈羊肚菌SOD進(jìn)行純化,對純化后酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、敏感性及同工酶類型等進(jìn)行研究。結(jié)果表明:熱擊法最佳熱擊溫度為60 ℃,最佳熱擊時(shí)間為15 min;硫酸銨分級沉淀法最佳鹽溶條件是采用40%飽和度硫酸銨,最佳鹽析條件是采用85%飽和度硫酸銨;所純化的SOD表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性,在60 ℃下保存60 min,其酶活保留超過50%,pH適應(yīng)范圍為6～9;Mn2+對羊肚菌SOD有明顯的激活作用,Fe2+對其有明顯的抑制作用;該SOD能耐受過氧化氫,但對氯仿-乙醇和SDS較為敏感,黑脈羊肚菌SOD屬于Mn-SOD類型。

黑脈羊肚菌,超氧化物歧化酶(SOD),純化,酶學(xué)性質(zhì)

羊肚菌是一類名貴的珍稀食藥用菌[1],泛指羊肚菌屬的多種真菌[2]。羊肚菌品種較多,主要包括羊肚菌(M.esculenta)、小羊肚菌(M.deliciosa)、高羊肚菌(M.elata)和黑脈羊肚菌(M.angusticeps)等8個(gè)種[3]。黑脈羊肚菌營養(yǎng)成分十分豐富,粗蛋白含量為7.87～9.79 g/100 g,粗脂肪含量5.44～6.30 g/100 g,粗纖維含量17.93～24.81 g/100 g,灰分含量8.18～10.17 g/100 g;含有K、Ca、Mg、Fe、Zn等多種人體必需的礦質(zhì)元素[4-5]。羊肚菌具有抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保肝護(hù)腎、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)以及降血壓等生物學(xué)功能[6-9]。

超氧化物歧化酶(surperoxidedismutase,SOD)是一種生物體內(nèi)防御氧化損傷的重要抗氧化劑,廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物內(nèi),是機(jī)體內(nèi)唯一以超氧陰離子為底物的酶,它能維持細(xì)胞內(nèi)氧自由基處于無害低水平狀態(tài)[10-11]。目前,國內(nèi)外關(guān)于羊肚菌化學(xué)成分研究較多的是氨基酸成分、無機(jī)元素以及多糖,而酶類的研究相對較少。本文以黑脈羊肚菌為研究對象,對其子實(shí)體中SOD的純化效果及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察,旨在為黑脈羊肚菌的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑脈羊肚菌 由昆明食用菌研究所提供;石英砂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀、鄰苯三酚、無水乙醇、EDTA·Na2均購自天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠;氯仿、鹽酸 均購自重慶川東化工有限公司;過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、NaOH、CaCl2、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、BaCl2、NaCl、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O等其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-4型恒溫水浴鍋 市杰瑞爾電器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)多用真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;TU1901型雙光束紫外可見光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TGL-16G飛鴿牌冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;79-1數(shù)顯恒溫加熱磁力攪拌器 天津市工興電器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液的提取 采用磷酸鹽緩沖液提取法。將黑脈羊肚菌子實(shí)體打磨成粉過40目篩,準(zhǔn)確稱取5 g置于研缽中,加入石英砂少許,預(yù)冷的150 mmol/L、pH7.8的磷酸鈉緩沖液150 mL,然后冰浴研磨勻漿4 h,六層紗布過濾,4 ℃、8000 r/min離心20 min,上清液即為粗酶液。4 ℃保存,待測。

1.2.2 粗酶液的純化

1.2.2.1 熱擊法純化SOD粗酶液 參照張麗[12]等的方法并稍作修改:取五份10 mL粗酶液,分別于50、55、60、65、70 ℃下對其進(jìn)行加熱處理20 min,而后立即放入冰水混合物中冷卻20 min,在4 ℃、8000 r/min下冷凍離心20 min,測定上清液酶活力和蛋白質(zhì)含量。再分別量取三份10 mL體積的粗酶液,將其置于最適熱擊溫度下水浴,分別在10、15、20 min時(shí)取出,冷卻、離心后,測定酶活力。

1.2.2.2 硫酸銨分級沉淀純化 參照武金霞[13]等的方法并稍作修改:取六份25 mL經(jīng)熱擊法純化后的粗酶液,緩慢加入(NH4)2SO4使其飽和度分別為30%、35%、40%、45%、50%、55%,置于層析柜中4 ℃下緩慢攪拌3 h,在4 ℃、8000 r/min下離心20 min,取上清液透析后測定酶活力。同樣方法,使其飽和度分別為70%、75%、80%、85%、90%、95%時(shí),測定酶活力。

1.2.3 黑脈羊肚菌SOD酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.3.1 溫度穩(wěn)定性 超氧化物歧化酶是一種金屬蛋白酶,分子中的金屬輔基使其具有短暫的耐熱性,為考察SOD的熱穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)量取六份1 mL純化后的酶液于60 ℃下分別保溫30、60、90、120、150、180 min后,以未處理的酶活力作為對照(100%),測定酶活性,重復(fù)3次。

1.2.3.2 pH穩(wěn)定性 溶液pH因改變酶蛋白與金屬輔基的結(jié)合狀態(tài)從而影響其活性,為了考察SOD的酸堿穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)量取十份1 mL的酶液,分別加入pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的緩沖液4 mL,其中pH3.0～5.0為0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,pH6.0～8.0為0.2 mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液,pH9.0～10.0為1/15 mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液,pH11.0～12.0為0.05 mol/L磷酸氫二鈉-0.1 mol/L氫氧化鈉緩沖液。混合均勻后,置于4 ℃下放置24 h后,以最適pH8.0時(shí)的酶活力作為對照(100%),測定酶活性,重復(fù)3次。

1.2.3.3 金屬離子對SOD活性的影響 在最適條件下,將適量的酶液與金屬鹽溶液(Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Na+、Cu2+、Zn2+)混合,使金屬離子的最終濃度分別為0.001、0.003、0.005、0.01、0.03、0.05、0.1 mol/L,4 ℃下放置3 h,以不加金屬離子的SOD的酶活性為100%計(jì),測定酶的殘余活力并計(jì)算相對活力。

1.2.3.4 SOD的敏感性實(shí)驗(yàn) 在2.0 mL酶液中分別加入1.5%的過氧化氫溶液5、10、15、20、25 μL,4 ℃下反應(yīng)30 min后取樣,以未處理的酶活力作為對照(100%),測定酶的殘余活力并計(jì)算相對活力。在2.0 mL酶液中分別加入2∶3(v/v)氯仿-乙醇溶液10、20、30、40、50 μL,4 ℃下反應(yīng)30 min后取樣,以未處理的酶活力作為對照(100%),測定酶的殘余活力并計(jì)算相對活力。在2.0 mL酶液中分別加入0.1、0.5、1.0、3.0、5.0 mmol/L的SDS溶液1.0 mL,4 ℃下反應(yīng)30 min后取樣,以未處理的酶活力作為對照(100%),測定酶的殘余活力并計(jì)算相對活力。

1.2.4 SOD比活力的測定

1.2.4.1 SOD酶活性測定 SOD酶活性測定采用改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法[14]。

鄰苯三酚自氧化速率測定:在25 ℃左右,于10 mL離心管中依次加入pH8.0 0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸緩沖溶液(內(nèi)含1 mmol/L EDTA·2Na)2.25 mL,蒸餾水2.1 mL,4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液0.15 mL。加入鄰苯三酚鹽酸溶液后立即混合并傾入比色皿,分別測定在325 nm波長條件下的吸光值,每30 s記錄1次OD隨時(shí)間的變化的值,讀取至330 s。計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度值的增加(ΔA),即為鄰苯三酚自氧化速率ΔA325/min。

表1 測定蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑用量表

以緩沖液代替酶液做空白。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。酶活定義為25 ℃時(shí)抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時(shí)所需的SOD的量為一個(gè)活力單位。

1.2.4.2 蛋白含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取6支試管編號,按表1依次加入試劑。注意:加入堿性硫酸銅溶液后將溶液混勻,室溫放置10 min,然后加入Folin-酚試劑,此時(shí)要求迅速將溶液混勻。從加入第一管Folin-酚試劑開始計(jì)時(shí),計(jì)時(shí)30 min后于500 nm處比色,測光密度值,用0號管作空白,其余每管重復(fù)三次,取平均值。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),光密度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為定量依據(jù)。

樣品的測定:取1 mL樣品溶液,按表2加入堿性硫酸銅溶液和Folin-酚試劑,測定光密度值,具體方法同上。

表2 測定樣品中蛋白質(zhì)含量的試劑用量表

1.2.4.3 SOD的比活力的計(jì)算方法 SOD的比活力按下面公式計(jì)算:

2 結(jié)果與討論

2.1 SOD粗酶液的純化

2.1.1 熱擊法純化SOD粗酶液

2.1.1.1 熱擊溫度對SOD純化的影響 由圖1可以得出,隨著加熱溫度的升高,黑脈羊肚菌中SOD提取液中的酶活損失率和蛋白去除率均呈上升趨勢,說明加熱可以去除SOD粗提液中的雜蛋白,同時(shí)酶也屬于蛋白質(zhì),所以溫度的上升,酶活性也會相應(yīng)的有損失。低于60 ℃時(shí),SOD的比活性隨著溫度的升高呈上升趨勢,因大部分蛋白質(zhì)的變性溫度為55 ℃,而SOD對溫度具有一定的穩(wěn)定性,所以當(dāng)溫度升至60 ℃時(shí),酶的比活力達(dá)到最大值,而此后隨著溫度的上升,SOD比活性有所下降,此時(shí)酶活損失的幅度大于雜蛋白的去除,說明溫度的進(jìn)一步升高加速了對SOD活性的破壞。因此,選取60 ℃為最佳熱擊溫度。

圖1 熱擊溫度對SOD酶純化效果的影響Fig.1 The effect of heating temperature on SOD purification

2.1.1.2 熱擊時(shí)間對SOD純化的影響 由圖2可以得出,在60 ℃下,隨著熱處理時(shí)間的延長,黑脈羊肚菌提取液中SOD酶活損失率和蛋白去除率均呈上升趨勢。在熱處理15 min前,SOD的比活力隨著熱處理時(shí)間的延長呈上升趨勢,當(dāng)15 min時(shí),SOD比活力達(dá)到最大。熱處理時(shí)間小于15 min時(shí),純化效果不理想,雖然酶活損失率較小,但雜蛋白的去除率也不大;熱處理時(shí)間大于15 min時(shí),蛋白去除率增大的幅度減小了,但酶活損失率增大的幅度反而增大。因此,選取15 min為最佳熱擊時(shí)間。

圖2 熱擊時(shí)間對SOD酶純化效果的影響Fig.2 The effect of heating time on SOD purification

2.1.2 硫酸銨分級沉淀純化SOD

2.1.2.1 最佳鹽溶硫酸銨飽和度 蛋白質(zhì)是親水性大分子,在水溶液中有雙電層結(jié)構(gòu),以此來保證分子的溶解度平衡并穩(wěn)定存在。在蛋白質(zhì)的水溶液中,加入少量的中性鹽,會增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷,增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子與水分子的作用,從而使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度增大,這種現(xiàn)象稱為鹽溶。利用此性質(zhì)可除去提取液中的不溶性蛋白,達(dá)到除雜的目的。由圖3可知,選擇40%的硫酸銨飽和度進(jìn)行鹽溶。

圖3 SOD的鹽溶曲線Fig.3 The salt-soluble curve of SOD

2.1.2.2 最佳鹽析硫酸銨飽和度 蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度,以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。向蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽時(shí),高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力,其對水分子的親和力大于蛋白質(zhì),可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,即蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失,使之“失水”,從而破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),使蛋白質(zhì)的溶解度降低而從水溶液中析出,同時(shí),中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后,由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變,蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和,更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低,使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。由圖4可知,選擇85%的硫酸銨飽和度進(jìn)行鹽析。

表3 黑脈羊肚菌SOD純化的結(jié)果

表4 金屬離子對SOD活性的影響

注:
注:小寫字母表示同一濃度下不同種類金屬離子對SOD活性的影響,小寫字母不同表示差異性顯著(p<0.05);大寫字母表示同一金屬離子不同濃度下對SOD活性的影響,大寫字母不同表示差異性顯著(p<0.05)。

2.1.3 純化的結(jié)果 將熱擊法和硫酸銨分級沉淀法對SOD粗酶液純化的結(jié)果比較見表3。

圖4 SOD的鹽析曲線Fig.4 The salting-out curve of SOD

由表3可知,在最佳提取條件下收集到的粗酶液依次經(jīng)過熱擊處理、硫酸銨分級沉淀法對其進(jìn)行初步純化,得到的黑脈羊肚菌SOD比活力達(dá)306.29 U/mg。

2.2 黑脈羊肚菌SOD酶學(xué)性質(zhì)測定

2.2.1 SOD的熱穩(wěn)定性 由圖5看出,60 ℃下隨著保溫時(shí)間的增加,SOD殘留相對酶活性逐漸減小,在加熱60 min后,酶活仍保留了一半以上,證明SOD的熱穩(wěn)定性較好。

圖5 SOD的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of SOD

2.2.2 SOD的pH穩(wěn)定性 由圖6可以看出,在pH6～9的范圍內(nèi),SOD的活性損失很少,殘留相對活性較高,可以認(rèn)為SOD對pH的適應(yīng)范圍較寬,是一種對pH比較穩(wěn)定的酶。

圖6 SOD的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of SOD

2.2.3 金屬離子對SOD活性的影響 由表4可知,當(dāng)向反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子后,多種金屬離子對SOD的酶活性均有一定的影響,并且隨著金屬離子濃度的不同,作用程度有所不同。Mn2+、Cu2+、Zn2+隨著離子濃度的增大,對SOD的激活作用先增大后減小,相對酶活性保持在100%～150%的范圍內(nèi)。而Ba2+、Na+隨著離子濃度的增大,對SOD的激活作用逐漸減小,甚至當(dāng)離子濃度大于0.03 mol·L-1時(shí),對其起到了抑制作用。Mn2+的激活作用最為明顯,相對酶活達(dá)到了184.1%。而Fe2+則對其具有非常明顯的抑制作用,當(dāng)金屬離子濃度達(dá)到0.1 mol/L時(shí),檢測不到酶活性。

2.2.4 SOD敏感性測定 由圖7可知,SOD能耐受過氧化氫,但對氯仿-乙醇和SDS非常敏感,隨著溶液加入量的增加,SOD的酶活逐漸降低。當(dāng)SDS溶液濃度達(dá)到5.0 mmol/L時(shí),酶的活性被抑制了65%。根據(jù)SOD酶的敏感性實(shí)驗(yàn):Cu、Zn-SOD對H2O2敏感,但能耐受SDS和氯仿-乙醇;Fe-SOD對SDS、H2O2和氯仿-乙醇均較敏感;Mn-SOD對SDS和氯仿-乙醇敏感,但能耐受H2O2[15-16]。由此可以推斷黑脈羊肚菌SOD屬于Mn-SOD。

圖7 SOD的敏感性實(shí)驗(yàn)Fig.7 Sensitive experiment of SOD

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以黑脈羊肚菌子實(shí)體為研究對象,研究了SOD的初步純化方法,并對純化后SOD酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及敏感性進(jìn)行研究,推斷出該SOD屬M(fèi)n-SOD。

熱擊法純化中,隨著加熱溫度的升高以及時(shí)間的延長,酶活損失率和蛋白去除率均呈上升趨勢,酶的比活力先增大后減小。這說明加熱能一定程度的去除雜蛋白,但是過高的溫度和過長的加熱時(shí)間也會加速酶活性的損失,因此選取最佳熱擊溫度為60 ℃,熱擊時(shí)間為15 min。硫酸銨分級沉淀法的實(shí)驗(yàn)中將硫酸銨飽和度調(diào)至40%,發(fā)生鹽溶現(xiàn)象,此步驟可除去不溶性蛋白,再將硫酸銨飽和度調(diào)至85%,此時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度降低導(dǎo)致鹽析,以此純化SOD。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SOD的熱穩(wěn)定性較好,在60 ℃下加熱30 min,酶活性能保留80%左右。在pH6～9的范圍內(nèi),SOD的活性損失很少,殘留相對活性較高,可以認(rèn)為SOD對pH的適應(yīng)范圍較寬,是一種對pH比較穩(wěn)定的酶。多種金屬離子對SOD的酶活性均有一定的影響,其中Fe2+對其具有非常明顯的抑制作用,當(dāng)Fe2+濃度達(dá)到0.1 mol/L時(shí),檢測不到酶活性。敏感性實(shí)驗(yàn)表明該SOD能耐受過氧化氫,但對氯仿-乙醇和SDS較為敏感,為黑脈羊肚菌SOD類型的推斷提供重要依據(jù)。

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Purification and characteristics of SOD inMorchellaangusticeps

HOU Yu-yan1,WU Su-rui2,ZHANG Li1,ZHAO Tian-rui1,*,TAI Li-mei2

(1.Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China;2.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply of Marketing Cooperative,Kunming 650221,China)

SOD inMorchellaangusticepswas purified by heating and ammonium sulfate graded precipitation. Then,the thermal stability,pH stability,sensitivity and isozyme types of SOD were also studied. Results showed that the best temperature and time of heating method was 60 ℃ and 15 min,respectively. The optimum mass fraction of ammonium sulfate for salt-soluble and salting-out were 40% and 85%,respectively. The purified SOD showed good thermal stability and pH stability. SOD retained more than 50% when save 60 min at 60 ℃and the accommodation pH was 6～9. Mn2+could significantly activate purify SOD,while Fe2+remarkably inhibit the activity of SOD. The SOD could tolerate hydrogen peroxide,however,it was sensitive to chloroform-ethanol and SDS. Therefore,this SOD belongs to Mn-SOD type.

Morchellaangusticeps;superoxide dismutase(SOD);purification;enzymatic properties

2014-09-22

侯玉艷(1990-),女,碩士研究生,主要從事食品科學(xué)研究,E-mail:493601137@qq.com。

*通訊作者:趙天瑞(1964-),男,本科,副教授,主要從事食品科學(xué)與工程研究,E-mail:food363@163.com。

國家科技支撐計(jì)劃課題(2013BAD16B01)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0147-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.023