周安玲,米 蘭,李霽昕,蔣玉梅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

幾株乳酸菌對(duì)干紅葡萄酒揮發(fā)性成分的影響

周安玲,米 蘭,李霽昕,蔣玉梅*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

以完成酒精發(fā)酵的干紅葡萄酒為原料,選用實(shí)驗(yàn)篩選的4株乳酸菌進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵(Malolactic fermentation,MLF),以未進(jìn)行MLF的試樣為對(duì)照,采用頂空固相微萃取、氣相色譜-質(zhì)譜(HS-SPME-GC/MS)聯(lián)用技術(shù)分析試樣揮發(fā)性組分。結(jié)果顯示,4個(gè)試樣中共檢出70種揮發(fā)性組分,其中酒樣C5檢出42種,N8檢出46種,N9檢出46種,N13檢出48種。CK檢出35種,MLF試樣揮發(fā)性物質(zhì)種類及揮發(fā)量均較對(duì)照多,表明MLF過程中有新的揮發(fā)性組分形成,對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)有修飾作用。4種乳酸菌中,篩自泡菜的C5菌株(Lactobacillus plantarum)用于MLF后酒樣酯類組分最高,相對(duì)含量達(dá)56.48%,酸類最低,占1.23%,酒樣揮發(fā)性組分構(gòu)成優(yōu)于其它菌株。

乳酸菌,揮發(fā)性化合物,蘋果酸-乳酸發(fā)酵,頂空固相微萃取,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

葡萄酒是以新鮮葡萄或葡萄汁為原料,經(jīng)過部分或全部發(fā)酵釀制而成,具有一定酒精度的發(fā)酵產(chǎn)品。香氣是評(píng)價(jià)葡萄酒品質(zhì)最為重要的指標(biāo)之一[1],葡萄酒的釀造過程酵母菌、乳酸菌等微生物代謝使得葡萄酒產(chǎn)品香氣表現(xiàn)得復(fù)雜和多樣[2]。目前已從葡萄酒中分離鑒定出約有800多種揮發(fā)性成分,主要包括醇、酯、有機(jī)酸、揮發(fā)性酚、內(nèi)酯、縮醛、芳香酮、萜烯類、脂肪酸、單萜醇氧化物等[3-5],共同作用形成了葡萄酒產(chǎn)品獨(dú)特的香氣風(fēng)格和特色。

蘋果酸乳酸發(fā)酵(Malolactic fermentation,MLF)是葡萄酒在乳酸細(xì)菌作用下將蘋果酸分解成乳酸和二氧化碳的過程,具有生物降酸、增加葡萄酒中微生物穩(wěn)定性和改善葡萄酒香氣,降低粗糙感,使之柔和、圓潤(rùn)的作用。對(duì)提高葡萄酒的感官質(zhì)量,改善葡萄酒風(fēng)味有重要影響。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于葡萄及葡萄酒揮發(fā)性組分進(jìn)行了大量的研究,但大多主要集中在葡萄酒中揮發(fā)性組分分類、感官閾值分析[6-7]、合成途徑與代謝機(jī)理研究[8],及葡萄酒揮發(fā)性組分釋放影響因素的研究[9-12]。關(guān)于MLF對(duì)葡萄酒揮發(fā)性組分的影響研究目前鮮見報(bào)道,Henick-Kling T認(rèn)為MLF可以改變葡萄酒中的水果香氣,產(chǎn)生新的活性香氣成分,從而影響了原有的香氣平衡[13]。能進(jìn)行葡萄酒乳酸發(fā)酵的細(xì)菌是乳酸菌的一些特殊的種,主要分屬于酒球菌屬(Oenococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)等,不同種的蘋果酸-乳酸菌釀酒特性不同,但目前不同乳酸菌MLF對(duì)香氣成分的影響研究較少。

本實(shí)驗(yàn)以酒精發(fā)酵結(jié)束后的赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、蛇龍珠(Cabernet Gernischet)、品麗珠(Cabernet franc)釀造的混合干紅葡萄酒為原料,選用實(shí)驗(yàn)篩選的4株乳酸菌(菌株編號(hào)分別為C5(Lactobacillusplantarum)、N8、N9、N13(LactobacillusBeijerinck)分別對(duì)其進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵(Malolactic fermentation,MLF),以未進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵的試樣為對(duì)照,采用頂空固相微萃取、氣相色譜-質(zhì)譜(HS-SPME-GC/MS)聯(lián)用技術(shù),分析4種不同菌株MLF后,葡萄酒香氣構(gòu)成的變化,比較所篩菌中對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)的影響確定與葡萄酒香氣品質(zhì)呈正相關(guān)的菌種,為葡萄酒MLF專用優(yōu)良乳酸菌菌株篩選及葡萄酒生產(chǎn)提供科學(xué)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、蛇龍珠(Cabernet Gernischet)、品麗珠(Cabernet Franc)葡萄 2013年10月采于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄園;商品釀酒酵母:紅佳釀Vintage Red(VR) 意大利Enartis公司;乳酸菌:C5 篩選自泡菜的植物乳桿菌株(Lactobacillus plantarum);N8、N9、N13 篩選自酸奶中的乳桿菌(Lactobacillus Beijerinck);果膠酶(Ex.color) 酶活力40000UPTE/mL,法國(guó)Lallemand公司。

SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸氣滅菌鍋 上海中安醫(yī)療器械廠;SPX-150-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;SSW-CJ-1FD凈化工作臺(tái) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;CP214型電子天平 奧豪斯儀器有限公司制造;HH-S型恒溫水浴鍋 金壇市恒豐儀器制造有限公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC型號(hào)TRACE 1310,MS型號(hào)ISQ) Thermo Scientific,USA;頂空固相微萃取器(DVB/Carboxen/PDMS(50/30 μm) SUPELCO,USA;色譜柱DB-WAXETR 60 m×0.25 mm×0.25 μm,thermo,USA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 酒精發(fā)酵:參照干紅葡萄酒的一般生產(chǎn)工藝流程釀造[14],赤霞珠、蛇龍珠、品麗珠除梗破碎按比例10∶33∶16混合,裝入10 L的棕色瓶,添加120 mg/L偏重亞硫酸鉀和20 mg/L果膠酶浸漬24 h,加入0.2 g/L活化好的紅佳釀酵母25 ℃發(fā)酵發(fā)酵7 d,殘?zhí)?4 g/L,完成酒精發(fā)酵。

MLF:紗布過濾進(jìn)行皮渣分離制得原料酒樣分裝到15個(gè)250 mL的棕色瓶中,接入實(shí)驗(yàn)選用4株乳酸菌,每株菌做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),乳酸菌參照文獻(xiàn)[15]活化,接種量約為1×107CFU/mL。于生化培養(yǎng)箱20 ℃發(fā)酵,每隔2 d以紙層析方法檢測(cè)蘋果酸、乳酸[16]。發(fā)酵12～18 d后MLF結(jié)束。酒樣品分別以菌株標(biāo)號(hào)C5、N8、N9、N13表示,以未進(jìn)行乳酸發(fā)酵樣品為對(duì)照(CK)。

供試樣品常規(guī)理化指標(biāo):還原糖、酒精度、FSO2和TSO2含量、干浸出物含量、滴定酸含量、pH和揮發(fā)酸含量等,檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家葡萄酒產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)(GB15037-2006)。

1.2.2 揮發(fā)性成分提取 準(zhǔn)確量取實(shí)驗(yàn)樣品5 mL于樣品頂空瓶中,加1.00 g NaCl和磁力攪拌子密封,250 ℃下老化1 h的固相微萃取頭于40 ℃下頂空吸附30 min,萃取結(jié)束插入GC-MS進(jìn)樣口,250 ℃解析10 min進(jìn)樣分析。

1.2.3 GC-MS條件分析 色譜條件:進(jìn)樣口溫度230 ℃;載氣為He;流速1 mL/min;不分流進(jìn)樣,15 min后打開分流閥,分流比20∶1;程序升溫:初溫60 ℃,2 ℃/min至170 ℃,5 ℃/min至230 ℃(10 min)。

質(zhì)譜條件:連接桿溫度230 ℃;離子源為EI源(70 eV),離子源溫度:250 ℃,質(zhì)量掃描范圍50～450 m/z。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 相對(duì)含量:峰面積歸一化法,扣除峰面積小于100或無法定性的雜質(zhì)峰計(jì)算總峰面積,組分相對(duì)含量(%)=各物質(zhì)離子流圖峰面積/總峰面積×100。

定性分析:由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)參考文獻(xiàn)資料[17-19]經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索NIST2011、Wiley及香精香料標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)分離揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行初步定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品揮發(fā)性物質(zhì)初步定性分析

固相微萃取結(jié)合GC-MS技術(shù)分析試樣及對(duì)照揮發(fā)性成分顯示,MLF試樣及對(duì)照試樣揮發(fā)性物質(zhì)的出峰時(shí)間主要集中在5 min到75 min(圖1～圖5)。

圖1 C5乳酸菌蘋乳發(fā)酵試樣總離子流圖Fig.1 Total iron chromatograms of C5 sample

圖2 N8乳酸菌蘋乳發(fā)酵試樣總離子流圖Fig.2 Total iron chromatograms of N8 sample

圖3 N9乳酸菌蘋乳發(fā)酵試樣總離子流圖Fig.3 Total iron chromatograms of N9 sample

圖4 N13乳酸菌蘋乳發(fā)酵試樣總離子流圖Fig.4 Total iron chromatograms of N13 sample

圖5 CK總離子流圖Fig.5 Total iron chromatograms of CK sample

MLF試樣中共初步分離定性出70種揮發(fā)性成分(表1),其中C5酒樣檢出42種,N8酒樣檢出46種,N9酒樣檢出46種,N13酒樣檢出48種,對(duì)照酒樣檢出35種。由此可見MLF可豐富葡萄酒的揮發(fā)性物質(zhì)的種類。這些化合物中,高級(jí)醇和酯是兩類最主要的揮發(fā)性組分,其中酯類25種,醇類25種,酸類6種,萜烯類6種,其他物質(zhì)8種。5種試樣共有的組分18種,醇類、酯類各占一半,MLF試樣共有的組分有25種,和對(duì)照試樣相比新增醇類3種,酯類2種,其他2種,且MLF試樣醇類、酯類相對(duì)含量發(fā)生變化。由此可見篩選出的乳酸菌進(jìn)行MLF后對(duì)葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的種類及相對(duì)含量均有影響。

2.2 醇類成分比較

試樣醇類物質(zhì)比較分析可知,C5、N8、N9、N13及對(duì)照試樣中總醇類的相對(duì)含量分別為39.35%、54.99%、67.20%、56.22%、30.82%,醇類個(gè)數(shù)分別為18、19、21、20、11。MLF試樣中醇類物質(zhì)種類及相對(duì)含量均高于對(duì)照(圖6)?？梢?MLF可以增加葡萄酒的醇類物質(zhì)種類及促進(jìn)醇類物質(zhì)的釋放。

圖6 不同來源乳酸菌株MLF后與對(duì)照酒樣醇類比較Fig.6 Comparison of alcohols indifferent MLF wine samples with control

5種試樣中共有的醇類組分8種,其中1-戊醇和苯乙醇的相對(duì)含量都顯著高于其他醇類。具有酒香、果香的1-戊醇在C5酒樣中相對(duì)含量最低,僅為對(duì)照的85%,在N13酒樣中相對(duì)含量最高,為對(duì)照的2倍。具有花香的苯乙醇在對(duì)照試樣中相對(duì)含量最低,是9.38%,MLF試樣中均有所增加,N8酒樣增加最多,為對(duì)照的2.5倍。葡萄酒中的高級(jí)醇主要是由氨基酸或己糖通過丙酮酸途徑生產(chǎn)的[13],乳酸菌菌株來源、菌屬及菌株個(gè)體存在差異,菌株代謝過程及酶活不同,最終導(dǎo)致代謝產(chǎn)物及次級(jí)代謝產(chǎn)物不同。

MLF試樣中共有醇類組分11種,較對(duì)照新增醇類物質(zhì)包括葉醇、芳樟醇、苯甲醇。這些醇類的相對(duì)含量均較小,感官表現(xiàn)為青香、花香和果香,對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)有一定修飾作用。MLF試樣中苯乙醇和正己醇的相對(duì)含量增加,這與張軍翔2006年研究的結(jié)果MLF葡萄酒中苯乙醇的含量減少不符[23],可能是發(fā)酵菌株不同造成的。

2.3 酯類成分比較

樣品中酯類物質(zhì)比較顯示,C5、N8、N9、N13及對(duì)照試樣中總酯類物質(zhì)相對(duì)含量分別為56.48%、37.20%、25.44%、35.24%、61.30%。MLF試樣酯類物質(zhì)相對(duì)含量均低于對(duì)照試樣(圖7)。MLF試樣的酯類個(gè)數(shù)和對(duì)照接近,但種類存在較大差異。C5酒樣酯類相對(duì)含量略低于對(duì)照,N9酒樣相對(duì)含量最低,為對(duì)照的42%,N8酒樣和N13酒樣的酯類相對(duì)含量相差不大,約為對(duì)照的一半。

5種試樣共有的酯類組分8種,分別為乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、水楊酸甲酯、乙酸苯乙酯、9-十六碳烯酸乙酯。MLF試樣中均新增酯類有2種,分別是正己酸乙酯、棕櫚酸乙酯,這些新增酯類感官表現(xiàn)為酯香、果香及奶油香,使葡萄酒香氣更豐富。酯類物質(zhì)是葡萄酒的重要香氣成分,絕大多數(shù)的酯類能產(chǎn)生令人愉悅的香氣,大部分酯類物質(zhì)感官特性為水果香味[24]。由此推測(cè),MLF試樣中,C5酒樣水果香較其他酒樣好。這可能是由于C5乳酸菌是篩自泡菜的植物乳桿菌,其酯酶活性較其他篩自酸奶的乳酸菌菌株高,促進(jìn)了酯類物質(zhì)的形成。

表1 葡萄酒樣的揮發(fā)性化合物組成

續(xù)表

注:
注:表中“-”表示未檢出;“—”表示感官特性未見報(bào)道。

圖7 不同乳酸菌株MLF后與對(duì)照酒樣酯類比較Fig.7 Comparison of esters indifferent MLF wine samples with control

2.4 酸類成分比較

由圖8可知,對(duì)照試樣檢測(cè)出6種揮發(fā)酸,相對(duì)含量占4.00%;C5酒樣酸類物質(zhì)種類及相對(duì)含量最少,占1.23%,僅為對(duì)照的31%;N9酒樣4種酸,占2.91%;N8和N13酒樣酸種類都為5種,相對(duì)含量分別為4.21%、3.46%。5種試樣中共有酸類2種,分別是乙酸和辛酸。和對(duì)照試樣相比,經(jīng)過乳酸發(fā)酵的試樣中乙酸含量都有所增加,C5酒樣增加最少,占0.75%。其他MLF試樣乙酸相對(duì)含量都較高,N8酒樣最高,達(dá)1.59%,其次是N13、N9,乙酸分別占1.4%和1.44%。辛酸在對(duì)照試樣中最高,達(dá)1.91%,4種MLF試樣均下降到0.6%以下。揮發(fā)酸具有不愉快的氣味,較高的揮發(fā)酸能掩蓋葡萄酒的香氣,對(duì)葡萄酒的感官品質(zhì)造成負(fù)面影響[25],所以認(rèn)為C5酒樣較其他酒樣香型更好。

圖8 不同乳酸菌株MLF后與對(duì)照酒樣酸類變化比較Fig.8 Comparison of acids indifferent MLF wine samples with control

2.5 主要揮發(fā)性組分的分析比較

5種試樣中相對(duì)含量較高的共有揮發(fā)性成分比較(圖9)顯示,對(duì)照試樣中的苯乙醇相對(duì)含量低于4種MLF試樣,N8酒樣相對(duì)含量最高,是對(duì)照的2.5倍,說明N8菌蘋乳發(fā)酵可顯著增加葡萄酒愉快的花香感;對(duì)照酒樣的辛酸乙酯相對(duì)含量最高,為其他試樣的2倍以上,可見MLF處理可降低辛酸乙酯的相對(duì)含量。N9和N13酒樣辛酸乙酯下降幅度最大,約為對(duì)照的16%。C5降低較少,約為對(duì)照43%;具有青草或香蕉香感的戊醇,在C5酒樣和N8酒樣的相對(duì)含量較低與對(duì)照無明顯差異,在N9酒樣和N13酒樣相對(duì)含量較高,為對(duì)照的2倍;C5酒樣中具有果香、酯香正己酸乙酯較高,其它三種酒樣的含量相差不大,對(duì)照酒樣中不含己酸乙酯,說明它是MLF生成的;具有香蕉、果香感的乙酸異戊酯在C5酒樣中含量最高,是對(duì)照的1.5倍,其他三種酒樣相差不大,僅為對(duì)照的一半。C5酒樣中各主要香氣物質(zhì)相對(duì)含量較均一,酒樣酒香、果香、花香、脂肪和醛香較為協(xié)調(diào);N8酒樣中具有花香、玫瑰香的苯乙醇占23.84%,花香突出;N9、N13酒樣中1-戊醇相對(duì)含量均最高,分別為29.96%、31.39%,青草香、香蕉香突出;對(duì)照酒樣中辛酸乙酯達(dá)到31.22%,花果香、醛香突出。

圖9 幾種酒樣主要揮發(fā)性成分比較Fig.9 Comparison of major volatile components from samples

3 結(jié)論

3.1 MLF試樣中共初步分離定性出70種揮發(fā)性成分,其中C5酒樣中檢出42種,N8酒樣檢出46種,N9酒樣檢出46種,N13酒樣檢出48種,對(duì)照酒樣檢出35種。MLF試樣中揮發(fā)性化合物種類均多于對(duì)照,釋放量較對(duì)照大。說明MLF過程樣品中有新的揮發(fā)性組分形成,同時(shí)促進(jìn)揮發(fā)性物質(zhì)的釋放。

3.2 5種試樣共有揮發(fā)性組分18種,MLF試樣共有組分25種,MLF新產(chǎn)生7種揮發(fā)性物質(zhì),分別是葉醇、芳樟醇、苯甲醇、正己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、大馬士酮。這些物質(zhì)主要增加了產(chǎn)品的青香、花香、果香、奶油香等香氣,對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)有修飾作用。

3.3 乳酸菌來源不同,MLF試樣香氣表現(xiàn)不同。C5酒樣,酯類相對(duì)含量最高,酸類相對(duì)含量最低,樣品酒香、果香、花果、脂肪和醛香相協(xié)調(diào);N8酒樣,醇類相對(duì)含量最高,花香突出;N9和N13酒樣中青草香、香蕉香突出;對(duì)照酒樣花果和醛香突出。相比于其他菌株C5乳酸菌MLF酒樣果香型較好且不良風(fēng)味物質(zhì)少。

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Impact of several strains of lactic acid bacteria on the volatile components of dry red wine

ZHOU An-ling,MI Lan,LI Ji-xin,JIANG Yu-mei*

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

The dry red wine completed the alcohol fermentation was used as raw material. 4 of lactic acid bacteria were screened to conduct malic acid-lactic acid fermentation(MLF),malolactic un-fermentation as control sample. The volatile components of samples were detected by head space solid-phase micro-extraction with gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME/GC-MS). The results showed that,70 volatile components were detected from 4 MLF samples,42,46,46 and 48 kinds of volatile compounds were separately determined from C5,N8,N9 and N13 sample. 35 kinds of volatile compounds were come from control sample. The quantity of volatile components from MLF samples were more than control sample,indicating some new volatile components were produced during MLF,at the same time,the quality of the wine aroma had a modification. The esters of C5 sample was higher than other 3 samples,the relative content of 56.48%,the volatile acids was minimum of 1.23%,the volatile quality was better than other test samples. C5 lactobacillus was filtrated from pickled vegetable.

lactobacillus;volatile compound;malolactic fermentation;headspace solid phase micro extraction(HS-SPME);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

2014-09-22

周安玲(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：1042501372@qq.com。

*通訊作者:蔣玉梅(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：果蔬加工、葡萄酒、食品風(fēng)味物質(zhì)分析的研究，E-mail：jym316@126.com。

“隴原青年創(chuàng)新人才扶持計(jì)劃”項(xiàng)目；財(cái)政廳甘肅省高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2010-1-235)；省科技廳科技支撐計(jì)劃(1011NKCA059)；盛彤笙科技創(chuàng)新基金(GSAU-STS-1335)。

TS262.6

A

1002-0306(2015)15-0136-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.021