寇 寧,李磊強(qiáng),李 欽,程衛(wèi)東,2,*

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730000;2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,廣東廣州 510515)

不同提取方法對(duì)紅芪多糖體外抗氧化活性的影響研究

寇 寧1,李磊強(qiáng)1,李 欽1,程衛(wèi)東1,2,*

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730000;2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,廣東廣州 510515)

紅芪多糖(HPS)是中藥紅芪中的主要成分。本文分別采用微波輔助、超聲輔助及常規(guī)熱水浸提從紅芪中提取HPS,經(jīng)脫蛋白、冷凍干燥后得到三種方法提取的紅芪多糖HPS-M、HPS-C和HPS-H。紅外光譜分析表明,HPS-M、HPS-C、HPS-H具有多糖的特征吸收峰;GPC測(cè)定結(jié)果顯示,HPS-M、HPS-C、HPS-H的重均分子量分別為6.29×105、4.56×105、5.13×105,多分散性分別為3.42、3.22、2.31。HPS-H、HPS-M、HPS-C清除羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基及還原力測(cè)定的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明,HPS-M的體外抗氧化活性要顯著高于HPS-C、HPS-H,因此,未來可考慮微波輔助法作為紅芪多糖提取的首選方法。

紅芪,多糖,體外抗氧化活性

紅芪為豆科植物多序巖黃芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.)的干燥根,具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效[1]。紅芪多糖(HPS)是紅芪的主要活性成分之一,是一種由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖[2],作為中醫(yī)常用傳統(tǒng)藥物在惡性腫瘤及各種退行性疾病的臨床治療與康復(fù)中用量較大[1]。李曉東等人的研究發(fā)現(xiàn),HPS-3能降低血糖,對(duì)T2DM大鼠的糖脂代謝紊亂有一定的調(diào)節(jié)作用,能促進(jìn)T2DM大鼠肝糖原的合成,修復(fù)受損的胰島β細(xì)胞,減輕T2DM大鼠胰島素抵抗[3]。衛(wèi)東峰等人利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),研究了HPS對(duì)S180瘤細(xì)胞化療協(xié)同增效作用的差異蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)了對(duì)S180小鼠瘤細(xì)胞化療增效作用的靶標(biāo)蛋白,而這些蛋白質(zhì)涉及能量代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡信號(hào)[4]。楊濤等人采用細(xì)胞溶血法對(duì)HPS的抗補(bǔ)體活性進(jìn)行研究結(jié)果表明,HPS具有一定程度的抗補(bǔ)體活性[5]。魏舒暢等人利用酶解提取紅芪總多糖的研究發(fā)現(xiàn),酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、溶劑pH、溶劑用量、提取時(shí)間等參數(shù)的選擇會(huì)影響活性成分的提取[6]。

綜上所述,對(duì)于HPS活性的研究,主要集中在降血糖、抗腫瘤等生物學(xué)活性方面,而多糖生物學(xué)活性與其清除自由基的能力密切相關(guān)。研究表明,不同的提取方法會(huì)影響多糖的清除自由基的活性,但對(duì)于不同方法提取的HPS的體外抗氧化活性的研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

本文以紅芪為原料,分別采用微波輔助、超聲輔助與常規(guī)熱水浸提提取HPS,并研究不同提取方法HPS的體外抗氧化活性,從而篩選出獲得體外抗氧化活性高的多糖的提取方法,以便為后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅芪藥材購自甘肅武都。

電子天平BL320H 北京賽多利斯天平有限公司;紫外可見分光光度計(jì)UV1000 北京萊伯泰科儀器有限公司;集熱式恒溫磁力攪拌器DF-101B 科瑞儀器有限公司;冷凍干燥機(jī)LGJ-18S 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;傅立葉紅外光譜儀 Nicolet380 美國熱電;Agilent GPC 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPS的提取 紅芪干燥根經(jīng)預(yù)處理后,根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7],采用超聲輔助、微波輔助和常規(guī)熱水浸提法對(duì)其多糖進(jìn)行提取,得到HPS-C、HPS-M、HPS-H,具體工藝如圖1所示。

圖1 紅芪多糖的提取工藝流程Fig.1 The extracting processes of HPS fromHedysarum polybotrys Hand.-Mazz

1.2.2 紅外光譜表征(FT-IR) 充分干燥的樣品與KBr壓片,用Thermo Nicolet iS10紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內(nèi)掃描,掃描次數(shù)16次,分辨率4 cm-1。

1.2.3 分子量測(cè)定 采用體積排阻色譜(GPC)測(cè)定分子量。紅芪多糖樣品用去離子水配成所需濃度的溶液,用微孔濾膜過濾,在690 nm波長下用GPC測(cè)定。進(jìn)樣量200 μL,流速為0.5 mL/min,溫度為25 ℃。

式(1)

1.2.5 對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用 精確稱取一定量的抗壞血酸(VC)與多糖樣品,用蒸餾水配制成濃度為0.04、0.06、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2、3 mg/mL的溶液,充分搖勻,備用。分別量取不同濃度的多糖溶液、VC溶液各0.1 mL,依次加入反應(yīng)液(20 mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液,2.67 mmol/L脫氧核糖,100 mmol/L EDTA)0.6 mL、0.4 mmol/L的硫酸亞鐵胺溶液0.2 mL、10 mmol/L過氧化氫溶液0.2 mL,在37 ℃水浴加熱15 min,再分別加入1%丙二酰硫脲溶液和2%的三氯乙酸溶液各1 mL,終止反應(yīng),然后沸水浴加熱15 mim后冷卻至室溫,以蒸餾水為空白調(diào)零,在532 nm下測(cè)定吸光值,得Ai,用蒸餾水代替樣品,測(cè)定A0,根據(jù)以下公式計(jì)算羥自由基(·OH)清除率[7-10],每個(gè)樣品重復(fù)三次,求平均值。

式(2)

式(3)

1.2.7 還原力 精確稱取一定量的抗壞血酸(VC),用蒸餾水配制成濃度為0.04、0.06、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2、3 mg/mL的溶液,充分搖勻,作為對(duì)照品備用。分別量取不同濃度的多糖溶液、VC溶液各1 mL,依次加入磷酸緩沖液(pH6.6)和鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液(1 wt%)各2.5 mL,混勻后50 ℃水浴20 min,然后加入三氯乙酸溶液(10 wt%)2.5 mL,混勻,1000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,再加入蒸餾水和氯化鐵(FeCl3,0.1 wt%)各2.5 mL,混勻,靜置10 min,蒸餾水調(diào)零,在700 nm處測(cè)定吸光值,每個(gè)樣品重復(fù)三次,以700 nm吸光值的平均數(shù)表示還原力的高低[7,9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理,組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),各組間比較采用雙尾t-檢驗(yàn),結(jié)果以Mean±SD表示,p<0.05表示差異顯著,p<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPS的紅外光譜

圖2為不同方法提取的紅芪多糖的紅外光譜圖。從圖2可以看出,三種方法得到的紅芪多糖在3418 cm-1有較強(qiáng)吸收峰,為O-H伸縮振動(dòng);2935 cm-1是由C-H伸縮振動(dòng)引起的;1618 cm-1附近的吸收峰是由COO-基團(tuán)的C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的;在1083 cm-1出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰是由糖環(huán)中C-O-C的伸縮振動(dòng)引起的。

圖2 紅芪多糖的紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectroscopy of HPS

2.2 HPS的分子量

HPS分子量的GPC色譜圖如圖3所示。由圖3可以看出,HPS的色譜圖的峰比較單一,表明HPS的組分沒有聚集。GPC測(cè)定的HPS-M、HPS-C、HPS-H重均分子量為6.29×105、4.56×105、5.13×105,多分散性分別為3.42、3.22、2.31。這主要是由于微波輻射導(dǎo)致紅芪多糖分子的交聯(lián),造成微波輔助提取后多糖分子量增大;超聲振動(dòng)會(huì)導(dǎo)致分子量斷裂,導(dǎo)致超聲輔助提取的紅芪多糖的分子減小。

圖3 紅芪多糖的GPC圖譜Fig.3 GPC chromatograms ofsamples Laser light scattering photometry for HPS

2.3 HPS的體外抗氧化活性

2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用 DPPH自由基是一種有機(jī)氮自由基,在517 nm處有吸光值,會(huì)隨著還原而逐漸的褪色。不同提取方法對(duì)HPS清除DPPH自由基的影響如圖4。由圖4可知,0.04～2 mg/mL的濃度范圍內(nèi),HPS-M、HPS-C、HPS-H對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的升高而增大,并呈劑量依賴;當(dāng)HPS的濃度高于2 mg/mL時(shí),這種趨勢(shì)不再明顯。HPS-M、HPS-C、HPS-H對(duì)DPPH自由基的EC50分別為0.52、0.63、0.72 mg/mL。HPS-M與HPS-C、HPS-H之間差異顯著(p<0.05),HPS-C與HPS-H之間差異不顯著。從圖4可以看出,HPS濃度較高時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率沒有顯著增強(qiáng),這可能主要是由于多糖的溶解度的限制以及氫鍵的增加所造成的。

圖4 不同提取方法對(duì)HPS清除DPPH·能力影響Fig.4 The DPPH radical scavenging activityof HPS at different extraction methods

2.3.2 對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用 超聲、微波、熱水三種提取方法對(duì)紅芪多糖HPS清除羥自由基(·OH)的影響如圖5所示。羥自由基是體內(nèi)產(chǎn)生的一種時(shí)間短、活性高的自由基,對(duì)有機(jī)體來說危害非常大,除超氧自由基外,羥自由基被認(rèn)為是與活細(xì)胞中所有功能性生物大分子反應(yīng)最有效的氧化劑[11-12]。由圖5可知,當(dāng)HPS的濃度在0.04～1.0 mg/mL時(shí),HPS對(duì)羥自由基的清除能力呈劑量依賴關(guān)系,隨濃度的增大而增強(qiáng);當(dāng)濃度超過1 mg/mL時(shí),紅芪多糖對(duì)羥自由基的清除能力隨濃度的增大趨勢(shì)逐漸減緩,達(dá)到平衡。HPS-M、HPS-C、HPS-H的半數(shù)清除濃度(EC50)分別為0.55、0.67、1.42 mg/mL。HPS-C和HPS-M對(duì)羥自由基的清除能力要明顯高于HPS-H,且差異顯著(p<0.05),其中微波提取的HPS-M對(duì)羥自由基的清除活性最高,但三種方法得到HPS清除羥自由基的能力均低于維生素C的清除能力。

圖5 不同提取方法對(duì)HPS清除·OH能力影響Fig.5 The ·OH radical scavenging activityof HPS at different extraction methods

圖6 不同提取方法對(duì)HPS 清除·能力影響Fig.6 The · radical scavenging activityof HPS at different extraction methods

2.3.4 還原力 多糖的還原能力主要是通過多糖存在時(shí)Fe3+-Fe2+的轉(zhuǎn)化所測(cè)定的。多糖的還原能力,是多糖所具有的抗氧化活性的重要指標(biāo)之一。不同處理方法對(duì)紅芪多糖HPS還原力的影響如圖7。由圖7可知,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),HPS-M、HPS-C、HPS-H的還原力隨濃度的增加而增強(qiáng)。在濃度為0.4 mg/mL之前,HPS-M、HPS-C、HPS-H的還原力增強(qiáng)趨勢(shì)不明顯,在0.4 mg/mL之后,隨著HPS濃度的增大,還原力明顯增強(qiáng),由此可知,HPS的還原力很大程度上依賴于濃度,濃度增大其活性基團(tuán)的濃度也隨之增加,相應(yīng)地還原力隨之增強(qiáng)。在濃度為0.04～0.2 mg/mL時(shí),HPS-M、HPS-C、HPS-H的差異不顯著,0.4 mg/mL時(shí),HPS-M與HPS-C、HPS-H的差異都顯著(p<0.05)。

圖7 不同提取方法對(duì)HPS還原能力影響Fig.7 The reducing power of HPSat different extraction methods

3 結(jié)論

3.1 紅外光譜分析表明,三種方法得到的HPS-M、HPS-C、HPS-H在3418、2935、1618、1083 cm-1都有吸收峰,此為多糖特征吸收峰,表明HPS-M、HPS-C、HPS-H均為多糖;GPC測(cè)定結(jié)果顯示,HPS-M、HPS-C、HPS-H重均分子量分別為6.29×105、4.56×105、5.13×105,表明微波、超聲均會(huì)對(duì)多糖的分子量產(chǎn)生影響。

3.2 體外抗氧化活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明,HPS-M、HPS-C、HPS-H清除羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基的能力依次減小,且HPS-M的體外抗氧化活性要遠(yuǎn)高于HPS-C、HPS-H。多糖清除羥自由基、DPPH自由基、超氧自由基以及其還原力會(huì)影響到紅芪多糖的調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤等方面的生物學(xué)活性,因此,出于對(duì)紅芪多糖生物學(xué)活性的考慮與提取效率的考慮,未來可選擇微波輔助法作為紅芪多糖的提取方法。

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Study on anti-oxidant activity of polysaccharides fromHedysarumpolybotrysHand.-Mazz. by different extraction methodinvitro

KOU Ning1,LI Lei-qiang1,LI Qin1,CHENG Wei-dong1,2,*

(1.College of Basic Medical Sciences,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China;2.College of Chinese Medicine,Southern Medical University,Guanzhou 510515,China)

Polysaccharides were one of the main components ofHedysarumpolybotrysHand.-Mazz(HPS). In this paper,the antioxidant activity of polysaccharides fromHedysarumpolybotrysHand.-Mazz with microwave-assisted extraction,ultrasonic assisted extraction and hot water extraction methods was investigated. HSP-M,HSP-C and HSP-H after deproteinization and vacuum freeze-drying were characterized by FT-IR and measured by GPC. The result indicated that HSP-M,HSP-C and HSP-H had typical absorption peak of polysaccharides,weight average molar mass(MW)were 6.29×105,4.56×105,5.13×105and polydispersion and gyroradius determined were 3.42,3.22,2.31. Anti-oxidant effect on scavenging DPPH radicals,OH radicals and superoxide radicals and reducing power on HSP-M,HSP-C and HSP-H were measured. The resualts showed that anti-oxidant effect of HSP-M was higher than HSP-C and HSP-H. To get practical methods for the research and manufacture of HPS,microwave-assisted extraction method should be chosen.

HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.;polysaccharides;anti-oxidant activityinvitro

2014-11-13

寇寧(1977-)，女，碩士研究生，講師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療常見病，E-mail:kouning1123@163.com。

*通訊作者:程衛(wèi)東(1961-)，男，博士，教授，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療常見病，E-mail:chengweidong888@sina.com。

基于不同君藥——紅芪替換經(jīng)典復(fù)方中黃芪免疫衰老機(jī)制比較研究(81373806)；用紅芪與用黃芪玉屏風(fēng)散的抗免疫老化機(jī)制比較研究(GZK-2012-43)；基于蛋白質(zhì)組學(xué)探討紅芪多糖延緩免疫衰老機(jī)制(GZK-2013-18)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)15-0100-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.013