賀玉萍，張 航，易曉紅

(1.成都中醫(yī)藥大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，四川 成都 611137;2.四川大學 華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041)

0 引 言

重組蛋白在生物化學、信號轉(zhuǎn)導、新藥篩選以及疾病治療等領(lǐng)域具有廣泛的需求，其制備工藝包括傳統(tǒng)的構(gòu)建穩(wěn)定細胞株表達和基因瞬時轉(zhuǎn)染表達.目前，在臨床及實驗室研究中，往往要求在短時間內(nèi)生產(chǎn)一定量的候選蛋白供應研究需求，這使得瞬時基因表達技術(shù)近年來得到廣泛應用［1］.聚乙烯亞胺(polyethylenimie，PEI)是基因瞬時轉(zhuǎn)染廣泛使用的轉(zhuǎn)染試劑，具有成本較低、操作簡便、適用宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高以及包裝容量不受限制等優(yōu)勢［2－4］.真核表達載體pCEP4 包含有EBNA-11 基因、EBNA Orip、CMV 啟動子、氨芐抗性和潮霉素篩選標記，可用于穩(wěn)定和瞬時轉(zhuǎn)染［5］.本研究通過構(gòu)建真核表達載體pCEP4/EGFP，PEI 介導瞬時轉(zhuǎn)染293-F 細胞，觀察轉(zhuǎn)染效率，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，擬為后續(xù)重組蛋白瞬時表達奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗所用材料包括:293-F 細胞和pREP4/EGFP質(zhì)粒為本實驗室保存;pCEP4 質(zhì)粒購自Life Technologies Corporation;Trans5α 感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)公司;限制性內(nèi)切酶Not I 和Hind III、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、T4 連接酶試劑盒購自TaKaRa;質(zhì)粒抽提試劑盒購自Omega bio-tek 和Promega;轉(zhuǎn)染試劑支化聚乙烯亞胺(polyethylenimie，branched)購自Sigma-aldrich;FreeStyle 293 Expression Medium 購自gibco;1640 培養(yǎng)液由本實驗室配制.

1.2 方 法

1.2.1 重組載體pCEP4/EGFP 構(gòu)建.

酶切pCEP4、pREP4/EGFP 質(zhì)粒，并回收目的片段(pCEP4 Not I/Hind III(10.2kb)，EGFP Not I/Hind III(0.8kb)).將回收的目的片段進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5α 感受態(tài)細胞.氨芐青霉素篩選培養(yǎng)，挑取陽性單克隆菌落至LB 液體培養(yǎng)基中，37℃，225 r/min搖菌過夜.提取質(zhì)粒，Not I/Hind III 雙酶切，電泳鑒定.

1.2.2 293-F 細胞的培養(yǎng)及重組載體的PEI 轉(zhuǎn)染.

1)24 孔板.將293-F 細胞接種于專用培養(yǎng)液(FreeStyle 293 Expression Medium)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng).鋪板前1 天以7 ×105cells/mL 的密度接種培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前3 h 以0.9 ×106cells/mL 的密度鋪24 孔板，置于搖床上培養(yǎng).配制PEI 濃度為1 mg/mL，pH 值調(diào)整為7.0，用0.22 μm 濾膜于潔凈條件下過濾;DNA濃度為1 μg/mL.配制DNA/PEI 混合物，N/P 范圍10～30，混合時用1640 培養(yǎng)液，室溫中放置10 min，轉(zhuǎn)染293-F 細胞，置于搖床上培養(yǎng)，分別于24 h、48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況.

2)懸浮培養(yǎng).轉(zhuǎn)染前24 h，293-F 以8 × 106cells/mL 的密度接種培養(yǎng)20 mL，懸浮培養(yǎng).轉(zhuǎn)染時細胞計數(shù)，細胞活力應達到90%以上，將細胞稀釋為1.5 ×106cells/mL，18 mL;DNA 用量為1 μg/mL，N/P 為25，混合時用1640 培養(yǎng)液，混合液為2 mL，室溫中放置10 min.轉(zhuǎn)染后細胞繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，130 r/min.48 h 后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率.

2 結(jié) 果

2.1 pCEP4、pREP4/EGFP 酶切后的目的片段

pCEP4、pREP4/EGFP 經(jīng)Not I 與Hind III 雙酶切后獲得的目的片段pCEP4(10.2kb)和EGFP(0.8kb)如圖1 所示.

圖1 pCEP4/EGFP 酶切后的目的片段

2.2 重組載體pCEP4/EGFP 的酶切鑒定

重組載體pCEP4/EGFP 雙酶切鑒定如圖2 所示，其與預期結(jié)果一致.

圖2 pCEP4/EGFP 重組載體的雙酶切鑒定

2.3 pCEP4/EGFP PEI 轉(zhuǎn)染293-F 細胞

2.3.1 24 孔板.

轉(zhuǎn)染24 h、48 h 后綠色熒光蛋白表達情況如圖3 所示.光鏡下觀察細胞狀態(tài)可見，懸浮細胞漂浮成團(24 孔板搖動幅度太小)，隨著PEI 濃度的增加，貼壁細胞數(shù)目亦增加.當N/P 為25，轉(zhuǎn)染48 h 后，轉(zhuǎn)染效率相對最高.

圖3 倒置熒光顯微鏡觀察(×50)

2.3.2 懸浮培養(yǎng).

懸浮培養(yǎng)排除細胞結(jié)團對轉(zhuǎn)染的影響，當N/P為25，轉(zhuǎn)染48 h 后，綠色熒光蛋白表達情況如圖4所示.利用流式細胞術(shù)檢測pCEP4/EGFP 的轉(zhuǎn)染效率為77.57%，結(jié)果如圖5 所示.

圖4 正置熒光顯微鏡觀察(×50)

圖5 流式細胞術(shù)檢測綠色熒光蛋白的表達

3 結(jié) 論

基因瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)作為一種快捷方便獲取重組蛋白的方法，可用于篩選大量蛋白候選藥物.PEI 介導的基因瞬時轉(zhuǎn)染效率取決于孵育得到的DNA/PEI 復合物的結(jié)構(gòu)、粒徑和表面電荷等因素以及細胞與復合物發(fā)生相互作用的過程.在轉(zhuǎn)染條件選擇上，主要考慮DNA 的用量，PEI 與DNA 的比例(N/P)［6］，DNA 與PEI 混合孵育的介質(zhì)、孵育時間以及轉(zhuǎn)染時間、細胞密度［7－10］.本研究以EGFP 為報告基因，探討了真核表達載體pCEP4 轉(zhuǎn)染293-F 細胞的條件，DNA 用量為1 μg/mL，N/P 為25，混合時使用1640 培養(yǎng)液，室溫孵育10 min，轉(zhuǎn)染前24 h 細胞以8 ×106～9 ×106cells/mL 的密度傳代，轉(zhuǎn)染時細胞密度為1.5 ×106cells/mL，同時保證細胞活力達到90%以上，可獲得較為理想的轉(zhuǎn)染效果.

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