許夢琦 李雙鈴 任艷 石延茂 王輝 尹亮 袁美 劉志文

摘要：利用AhMITE、SSR、SRAP及SRAP-RGA 4種分子標記技術研究了花生（Arachis hypogaea Linn）作圖親本花育22號與“950527”間的分子多態(tài)性。經過初篩和復篩，822對AhMITE引物、1 106對SSR引物、460對SRAP和731對SRAP-RGA引物在兩親本間表現(xiàn)穩(wěn)定多態(tài)性的數(shù)量分別為101、207、25和72對，多態(tài)性比率分別為12.3%、 18.7%， 5.4%和9.8%。結果表明，SSR標記揭示作圖親本間多態(tài)性的效率最高，其次是AhMITE標記，SRAP標記的多態(tài)性和重復性最差。

關鍵詞：花生（Arachis hypogaea Linn）；多態(tài)性；分子標記；SSR；AhMITE；SRAP；SRAP-RGA

中圖分類號：S565.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2763-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.054

Polymorphic Analysis of Molecular Markers between Mapping Parents in Peanut

XU Meng-qi1，2，LI Shuang-ling2，REN Yan2，SHI Yan-mao2，WANG Hui2，YIN Liang2，YUAN Mei2，LIU Zhi-wen1

（1. School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China； 2. Shandong Peanut Research Institute/Shandong Provincial Key Laboratory of Peanut/Key Laboratory of Peanut Biology and Genetic Improvement， Ministry of Agriculture， Qingdao 266100， Shandong， China）

Abstract： Polymorphism between two mapping parents Huayu 22 and “950527” in peanut（Arachis hypogaea Linn） was screened by using four types of molecular marker technology， including AhMITE，SSR，SRAP and SRAP-RGA. After primary and secondary screening with 822 pairs of AhMITE，1 106 pairs of SSR，460 pairs of SRAP and 731 pairs of SRAP-RGA primers， 101，207，25 and 72 pairs of primers were detected， respectively，showing stable polymorphism between the two parents， and the polymorphism ratios were 12.3%，18.7%，5.4% and 9.8%，separately. The results showed that， SSR markers are most efficient in revealing polymorphism between the mapping parents， followed by AhMITE markers， and SRAP markers are the worst in polymorphism and repeatability.

Key words： peanut（Arachis hypogaea Linn）； polymorphism； molecular markers； SSR； AhMITE； SRAP； SRAP-RGA

花生（Arachis hypogaea Linn）栽培種（2n=4x=40）起源于玻利維亞南部和阿根廷北部，是世界上重要的經濟和油料作物之一，也是許多發(fā)展中國家植物油和蛋白質的重要來源[1]。花生的常規(guī)育種方法存在育種周期長、對目標單株的選擇效率低、成本高等難以克服的缺點[2]。20世紀80年代以來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，分子標記技術被廣泛應用于現(xiàn)代作物遺傳育種研究的各個方面，并取得了豐碩成果[3-6]，許多過去無法進行的研究在分子標記的幫助下得以開展，大大加快了花生育種工作的進程[5，7]?；ㄉa量、油分含量和抗逆性均為復雜的數(shù)量性狀，從分子水平研究其遺傳基礎必將有助于改良這些性狀，從而育成高產、高油、多抗的花生新品種，而高質量遺傳圖譜則是在分子水平上研究復雜性狀的基礎和保證[8-12]。

花生根結線蟲病是中國大部分花生生產區(qū)經常發(fā)生的一種具有毀滅性的病害。目前，花生根結線蟲病波及面積越來越廣，病害趨勢也逐步加重，嚴重影響了花生的產量和品質，大大降低了農民的收入。而防治此種病害的農藥如神農丹、呋哺丹等都是高毒高殘留農藥，不僅污染環(huán)境，而且對人類的健康造成了不可估量的危害。農藥的使用終歸治標不治本，培育抗根結線蟲病花生品種才是控制花生根結線蟲病危害的最理想的途徑[13]，而分子遺傳連鎖圖譜的構建可為抗病基因的定位、克隆以及抗根結線蟲病分子育種奠定基礎。本研究以農藝性狀優(yōu)良但對花生根結線蟲病表現(xiàn)感病的花生材料花育22號和表現(xiàn)高抗的“950527”為作圖親本，利用AhMITE、SSR、SRAP及SRAP-RGA 4種分子標記技術研究了花育22號、“950527”、抗病混和池和感病混和池間的分子多態(tài)性，以期為花生高質量遺傳圖譜的構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

所用花生親本為農藝性狀優(yōu)良但感病的材料花育22號和高抗材料“950527”，以花育22號為父本，“950527”為母本進行雜交獲得F1代。第二年經分子水平鑒定和田間表型鑒定，選擇真雜種F1代單株混收獲得F2代種子，編號為AA72。第三年種植F2代種子于山東省花生研究所線蟲病圃，播種后35 d逐株進行抗病性鑒定，鑒定標準參照文獻[14]。鑒定后將感病和抗病植株各隨機選取30個單株并提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 花生基因組DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）。通過1%瓊脂糖凝膠檢測DNA質量，并用紫外分光光度計測量濃度后，將親本DNA稀釋到10 ng/μL待用。將挑選出的感病和抗病的F2單株DNA分別混合構成感病混合池和抗病混合池DNA，使其終濃度均為10 ng/μL。

1.2.2 引物 所用SSR引物來自Zhao等[15]，AhMITE引物來自Shirasawa等[16，17]，SRAP和SRAP-RGA引物來自王潔[18]。

1.2.3 PCR反應體系和熱循環(huán)程序 PCR反應體系為10 μL，含5 μL 2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]、0.3 μL正向和反向引物（10 μmol/L）、2 μL基因組DNA（10 ng/μL）、2.4 μL ddH2O。

各標記PCR反應擴增程序為：①AhMITE標記。94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min； 4 ℃保存。②SSR標記。94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。③SRAP標記。94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)5次；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。④SRAP-RGA標記： 94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min， 45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)5次；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.4 電泳檢測和數(shù)據(jù)分析 AhMITE和SSR標記使用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，180 V電壓電泳1 h；SRAP和SRAP-RGA標記用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，500 V電壓電泳2 h。電泳緩沖液均為0.5×TBE。電泳結束后，用0.1% AgNO3進行染色，并拍照保存。

多態(tài)性比率為多態(tài)性標記數(shù)占篩選標記總數(shù)的百分比。

2 結果與分析

利用兩個親本DNA和兩個混合池DNA對822對AhMITE引物、1 106對SSR引物、460對SRAP引物組合和731對SRAP-RGA引物組合進行了初次篩選。圖1為部分引物的篩選結果，如圖1中的箭頭所示，圖1A中的AhMITE0615，圖1B中的SSR-C5、C12、D6，圖1C中的M7fE22均在親本間表現(xiàn)多態(tài)性；圖1D中的R25RE05和R25RE09則在親本間和感抗池間均表現(xiàn)多態(tài)性。由表1可知，在所篩選的4種標記中，兩親本間SSR標記的多態(tài)性比率最高（39.0%），其次是AhMITE標記（29.7%）和SRAP-RGA標記（28.9%），SRAP標記最低（23.3%）；感抗池間的多態(tài)性比率明顯低于感抗親本間，SSR標記的多態(tài)性比率最高，其次是SRAP-RGA標記和AhMITE標記，SRAP標記最低。從初篩結果可以看出，兩個作圖親本間表現(xiàn)多態(tài)性的分子標記總數(shù)達到933，遠遠達不到高密度分子遺傳圖譜構建的要求。前人的研究表明，花生栽培種間遺傳基礎狹窄，因此基于PCR擴增的第二代分子標記的多態(tài)性水平比較低，可用于花生圖譜構建的多態(tài)性分子標記數(shù)量還十分有限[6，15]。

為了進一步驗證初篩結果的重復性和穩(wěn)定性，用初篩得到的多態(tài)性分子標記對兩個親本和感抗池間DNA進行第二輪和第三輪篩選。由于復篩后感病混合池和抗病混合池間多態(tài)性的重復性很低，因此統(tǒng)計多態(tài)性分子標記時只統(tǒng)計感抗親本間多態(tài)性比率（表2）。與初篩結果相比，4種分子標記的多態(tài)性標記數(shù)量大大減少，AhMITE多態(tài)性標記數(shù)由244減少到101，SSR多態(tài)性標記數(shù)由431減少到207，SRAP多態(tài)性標記數(shù)由107減少到25，SRAP-RGA多態(tài)性標記數(shù)由211減少到72。從多態(tài)性比率來看，SSR標記的多態(tài)性比率最高（18.7%），AhMITE標記（12.3%）和SRAP-RGA標記（9.8%）次之，SRAP標記最低（5.4%）。經3次篩選出的多態(tài)性分子標記總數(shù)達到405，可用于F2代群體單株的基因分型，為下一步的花生栽培種分子遺傳圖譜的構建和抗線蟲基因定位奠定了基礎。

3 討論

3.1 關于初篩與復篩的多態(tài)性標記數(shù)量

本研究中，復篩得到的多態(tài)性標記數(shù)量遠遠低于初篩結果。造成此現(xiàn)象的原因可能是在初篩的擴增過程中，由于模板或引物濃度過高、Taq酶量過多、引物特異性差、擴增循環(huán)次數(shù)過多及Mg2+濃度偏高等原因引起PCR擴增中出現(xiàn)一些非特異擴增。這些非特異擴增導致初篩結果統(tǒng)計的多態(tài)性標記數(shù)量偏高，但并不能穩(wěn)定保持，因此在復篩過程中并沒有出現(xiàn)。同時， 為了保證下一步的F2代群體單株基因分型的準確性和重復性， 在復篩結果統(tǒng)計中只統(tǒng)計差異條帶強的標記數(shù)。PCR擴增中使用的天根生化科技（北京）有限公司生產的2×Taq PCR MasterMix包含Buffer，dNTPs和Taq酶，對低質量和微量的DNA均具有極好的擴增效果，其中Taq酶和Mg2+的濃度固定，在下一步的試驗中可嘗試在不影響擴增效果的前提下，優(yōu)化Mix的用量或降低PCR循環(huán)次數(shù)，以降低非特異擴增出現(xiàn)的概率，并得到更清晰、穩(wěn)定的條帶。

3.2 4種分子標記的比較

本研究中不同分子標記的多態(tài)性比率差異較大。AhMITE標記、SSR標記、SRAP標記及SRAP-RGA標記的多態(tài)性比率分別為12.3%、18.7%、5.4%和9.8%，其中SSR標記的多態(tài)性比率最高，其次是AhMITE標記和SRAP-RGA標記，而SRAP標記的多態(tài)性比率最低。在擴增的穩(wěn)定性和重復性方面，AhMITE和SSR標記較好，SRAP-RGA標記次之，SRAP標記最差。綜合來看，SSR標記在花育22號與“950527”這對作圖親本中的應用效果最好，而SRAP標記的多態(tài)性和重復性最差。

3.3 不同作圖親本間的多態(tài)性比較

本研究對作圖親本花育22號與“950527”進行了822對AhMITE引物、1 106對SSR引物、460對SRAP引物組合和731對SRAP-RGA引物組合的初篩和復篩，其中表現(xiàn)穩(wěn)定多態(tài)性的標記數(shù)量分別為101、207、25和72，多態(tài)性比率分別為12.3%、18.7%、5.4%和9.8%，整體的多態(tài)性比率為13.0%。山東省花生研究所細胞工程實驗室對花生的另一個作圖群體的親本花育22號與D99的多態(tài)性標記的篩選結果為，在823對AhMITE引物、2 172對SSR引物、460對SRAP引物組合和507對SRAP-RGA引物組合中，篩選出了多態(tài)性穩(wěn)定的84對AhMITE引物、188對SSR引物、8對SRAP引物組合和8對SRAP-RGA引物組合，4種標記的多態(tài)性比率分別為10.2%、8.7%、1.7%和1.6%，整體的多態(tài)性比率為7.3%。比較這兩對作圖親本的分子標記多態(tài)性比率，本研究中花育22號與“950527”這對作圖親本的多態(tài)性比率整體略高。因此可以得出結論，花育22號與“950527”這對作圖親本的多態(tài)性比率在正常范圍內。

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