粟 鳳，林安曉，喬東方，丁 菁，陸德琴

(貴陽醫(yī)學院 病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550004)

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葛根素減輕大鼠心肌缺血-再灌注損傷

粟 鳳，林安曉，喬東方，丁 菁，陸德琴*

(貴陽醫(yī)學院 病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550004)

葛根素(puerarin, PUE)注射液對心肌缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, I/R)具有保護作用[1]，但其作用機制尚不完全清楚。內皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)功能障礙已被認為是心血管疾病發(fā)病中的一個重要環(huán)節(jié)。PUE的心肌保護作用機制是否與eNOS有關？本實驗擬采用大鼠心肌I/R損傷模型，探索PUE的心肌保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑： 清潔級雄性SD大鼠54只，體質量200～250 g[貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證序號為SCXK(渝)2011- 0005]。PUE注射液(湖北天藥藥業(yè)有限公司)。NO檢測試劑盒(Calbiochem公司)；兔抗eNOS Ser1177抗體、兔抗eNOS Ser633抗體(Millipore公司)；兔抗β-tubulin抗體、兔抗eNOS抗體及HPR標記的羊抗兔的二抗(Santa Cruz公司)；TTC(Solarbio公司)；CK-MB和cTnI檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理，大鼠隨機分為3組。1)假手術(sham)組；2)I/R組：參照文獻[2]復制心肌I/R模型，結扎LAD 45 min后放松結扎線120 min；3)PUE組：結扎LAD前15 min經(jīng)左頸靜脈注射PUE(2.5 mL/kg，濃度40 g/L)，其余操作同I/R組。

1.2.2 左室血流動力學指標測定，采用BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟公司)測定左室血流動力學，記錄缺血前、缺血45 min及再灌注120 min時左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)及左心室內壓力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

1.2.3 心肌梗死面積測定，TTC法測定心肌缺血和梗死面積。以缺血區(qū)心肌重量與左室重量之百分比表示缺血面積，以梗死區(qū)心肌重量與缺血區(qū)心肌重量之百分比表示梗死面積。

1.2.4 血漿CK-MB及cTnI測定，再灌注結束后，經(jīng)頸動脈取血5 mL，3 000 r/min離心20 min分離血漿，嚴格按照ELISA試劑盒說明書測定血漿CK-MB及cTnI。

1.2.5 缺血區(qū)心肌組織eNOS蛋白及磷酸化檢測，采用蛋白印跡法進行檢測。用Bio-Rad凝膠圖像分析軟件分析蛋白條帶相對積分吸光度值。

1.2.6 缺血區(qū)心臟組織NO含量測定，嚴格按照試劑盒說明書測定組織中NO2-/NO3-的含量。

2 結果

2.1 左室血流動力學指標：與sham組比較，I/R組各時間點LVSP、±dp/dtmax下降，LVEDP升高(P<0.05)。與I/R組比較，PUE組各時間點LVSP、±dp/dtmax升高，LVEDP降低(P<0.05)。

2.2 心肌梗死面積：與I/R組比較，PUE組心肌梗死面積明顯減小(P<0.05)(表1)。

表1 各組心肌缺血區(qū)面積及梗死面積的比較

groupischemiasizeinfarctsizesham00I/R47.04±1.6342.19±2.55PUE45.26±2.9527.12±3.38*

*P<0.05 compared with I/R group.

2.3 血漿CK-MB活力和cTnI濃度：與sham組比較，I/R組血漿CK-MB活力及cTnI濃度明顯升高(P<0.05)，PUE處理后血漿CK-MB活力及cTnI濃度明顯降低(P<0.05)(表2)。

表2 血漿CK-MB活力和cTnI濃度

groupCK-MBactivity(U/mL)cTnIlevels(ng/mL)sham27.27±0.817.30±0.94I/R40.60±2.04*20.55±1.79*PUE30.18±1.14*#11.83±1.16*#

*P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with I/R group.

2.4 缺血區(qū)心臟組織eNOS蛋白及eNOS Ser1177和Ser633的磷酸化水平：與sham組、I/R組比較，PUE組eNOS Ser1177及Ser633的磷酸化水平顯著增高(P<0.05)(圖1)。

2.5 缺血區(qū)心臟組織NO含量：I/R組與sham組間NO含量無明顯差異，經(jīng)PUE處理后NO含量明顯增高(P<0.05)(表3)。

表3 缺血區(qū)心臟組織NO2-/NO3-含量

groupNO2-/NO3-(mol/gprotein)sham 1.13±0.15I/R 1.14±0.12PUE 1.48±0.32*#

*P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with I/R group.

3 討論

大量研究表明PUE對心肌I/R損傷具有保護作用[1]，筆者也曾發(fā)現(xiàn)PUE能明顯減輕大鼠心肌I/R損傷，但其作用機制尚不清楚。PUE明顯減小心肌梗死面積，并提高血清NO水平[3]。已經(jīng)公認eNOS及其產(chǎn)生的NO具有明顯心肌保護作用。而eNOS Ser1179/1177及Ser635/633磷酸化可顯著上調eNOS的活性，使NO生成增多[4]。本文表明PUE對缺血區(qū)心肌組織eNOS總蛋白表達無明顯影響，但eNOS Ser1177及Ser633水平均明顯升高，導致酶活性增加及NO生成增多，明顯改善了I/R損傷心肌的舒縮功能、減少梗死面積、減輕損傷，具有保護效應。本研究提示PUE的心肌保護機制可能與其上調eNOS Ser1177及Ser633磷酸化水平有關。

*P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with I/R group圖1 各組缺血區(qū)心臟組織eNOS總蛋白及eNOS(Ser1177和Ser633)磷酸化水平Fig 1 The levels of eNOS total protein and p-eNOS (Ser1177 and Ser633)in ischemia area of heart tissue in each group

[1] 周玉娟, 魏繼承. 葛根素對心肌缺血-再灌注損傷的保護機制及其臨床應用[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2008, 5: 1259- 1260.

[2] 劉艷偉, 劉水平, 成建定,等. 大鼠心肌缺血再灌注模型的改進及心電圖判斷指標[J]. 實用兒科臨床雜志, 2007, 22: 525- 527.

[3] 李軍, 黃可欣, 王元春. 葛根素對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌酶的影響[J]. 中國實驗診斷學, 2013, 17: 244- 246.

[4] Michel T, Vanhoute PM. Cellular signaling and NO production [J]. Pflugers Arch, 2010, 495: 807- 816.

2014- 11- 14

2015- 03- 23

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