王福青 周 偉 赫欣

脂聯(lián)素重組體對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移的影響

王福青 周 偉 赫欣

目的 探討結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-480中脂聯(lián)素受體的表達(dá)情況以及人脂聯(lián)素重組體對(duì)結(jié)腸癌體外增殖侵襲能力的影響。方法 通過(guò)RTPCR試驗(yàn)檢測(cè)脂聯(lián)素受體1和受體2在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，然后將SW-480細(xì)胞分設(shè)對(duì)照組和脂聯(lián)素重組體作用(1、10、30、45、60μg/mL)組，作用后，分別以MTT法、劃線(xiàn)遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脂聯(lián)素重組體對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。結(jié)果 脂聯(lián)素受體1、2在該細(xì)胞株中均有表達(dá)，脂聯(lián)素重組體質(zhì)量濃度高于10μg/mL時(shí)，對(duì)SW-480細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用(P<0.01)，抑制作用隨著濃度增高而增強(qiáng)；當(dāng)脂聯(lián)素重組體濃度大于30μg/ mL時(shí)，能明顯地降低腫瘤細(xì)胞體外侵襲遷移能力(P<0.01)，抑制率隨脂聯(lián)素重組體濃度的升高而增加，介于1.8%～42.0%之間。結(jié)論 脂聯(lián)素重組體在大于10g/mL時(shí)，可能對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖遷移產(chǎn)生較為明顯的影響。

脂聯(lián)素；結(jié)腸癌細(xì)胞；脂聯(lián)素受體；侵襲；轉(zhuǎn)移

近年來(lái)研究表明，脂肪組織不僅是一個(gè)被動(dòng)的儲(chǔ)能器官，還可分泌多種具有重要生物活性的蛋白。其中脂聯(lián)素（adiponectin）就是其中一種重要的細(xì)胞因子，在與肥胖相關(guān)的疾病中起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。脂聯(lián)素的活性形式主要以球形結(jié)構(gòu)域和全長(zhǎng)形式存在，球形結(jié)構(gòu)域比全長(zhǎng)脂聯(lián)素能更有效地改善胰島素抵抗和增加脂肪酸氧化，具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性。脂聯(lián)素有2種受體：AdipoR1和AdipoR2，其中AdipoR1與gAd具有高度的親和力，但與全長(zhǎng)脂聯(lián)素親和力較低，AdipoR2對(duì)2種脂聯(lián)素的親和力相近，均為中等強(qiáng)度。脂聯(lián)素通過(guò)脂聯(lián)素受體使細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)應(yīng)答反應(yīng)并受脂聯(lián)素受體的影響[2]。

脂聯(lián)素生理作用的研究主要集中在與肥胖相關(guān)的一些疾病上，尤其是與Ⅱ型糖尿病胰島素抵抗相關(guān)的研究。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素與乳腺癌[3]、子宮內(nèi)膜癌[4]、前列腺癌[5]以及消化道癌癥等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。眾多研究證據(jù)顯示脂聯(lián)素水平的降低可能與結(jié)直腸癌癥[6-7]的發(fā)生密切相關(guān)，但這些研究多集中于體內(nèi)脂聯(lián)素水平以及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，在脂聯(lián)素的體外作用方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480為觀察對(duì)象，檢測(cè)細(xì)胞脂聯(lián)素受體的表達(dá)情況，并觀察不同濃度脂聯(lián)素球形結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長(zhǎng)、遷移的抑制作用，為結(jié)腸癌的治療提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 L-15培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司，血清購(gòu)自四季青生物有限公司，脂聯(lián)素球形結(jié)構(gòu)域購(gòu)自愛(ài)迪博生物科技有限公司，RNA提取試劑盒、RT-PCR、Trizal、Taq酶以及DNA Ladder均購(gòu)自寶生物工程有限公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞從上海中科院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)，培養(yǎng)條件為含10%小牛血清的L-15培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，傳代采用0.25%胰蛋白酶消化。

1.2 方法

1.2.1 脂聯(lián)素受體的表達(dá)檢測(cè) SW480細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48h，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用Trizal試劑盒提取總RNA。隨后，采用RT-PCR試劑盒合成cDNA，最后以此cDNA為模板對(duì)脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2進(jìn)行擴(kuò)增。目標(biāo)基因的引物序列分別是：（1）AdipoR1：上游引物序列：5-AAACTGGCAACATCTGGACC-3，下游引物序列：5-GCTGTGGGGAGCAGTAGAAG-3，全長(zhǎng)約 300bp；（2）AdipoR2：上游引物序列5-ACAGGCAACATTTGGACACA-3，下游引物序列5-CCAAGGAACAAAACTTCCCA-3，全長(zhǎng)約407bp。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性10min，隨后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95℃變性20s，60℃復(fù)性15s，72℃延伸30s，循環(huán)結(jié)束后延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳并在成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT法） 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×103/mL，接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。加入脂聯(lián)素重組體，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和5個(gè)質(zhì)量濃度梯度(1、10、30、45、60μg/mL)，每組做3個(gè)平行孔，終體積為200μL，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μL質(zhì)量濃度為5mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，每孔加入100μL的DMSO，震蕩10min，492nm測(cè)定光密度值。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)＝（1－實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）× 100%。

1.2.3 細(xì)胞遷移檢測(cè) 利用劃線(xiàn)法進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。參照Weis等方法進(jìn)行劃痕遷移實(shí)驗(yàn)。將結(jié)腸癌細(xì)胞以5×103濃度接種于24孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)至80%，棄舊培養(yǎng)基，用20～200μL微量移液器槍頭在孔中央劃垂直痕，寬度為350μm，用PBS洗2次，在孔中分別加入3個(gè)質(zhì)量濃度梯度的脂聯(lián)素(10、30、45、60μg/mL)和PBS陰性對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，加培養(yǎng)基至500μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡觀察，每個(gè)復(fù)孔隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，計(jì)算遷移的細(xì)胞數(shù)，并測(cè)量劃痕邊緣的細(xì)胞向劃痕區(qū)遷移的距離。計(jì)算脂聯(lián)素對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲抑制率。

抑制率(%)=(對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)－給藥組侵襲細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 RNA的提取及脂聯(lián)素AdipoR1和AdipoR2在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中的表達(dá) 以結(jié)腸癌細(xì)胞RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出長(zhǎng)度大約為300bp及430bp的2條片段，與預(yù)期的目的片段大小相符。見(jiàn)圖1。說(shuō)明脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2在結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480中均有轉(zhuǎn)錄。

圖1 脂聯(lián)素受體表達(dá)情況

2.2 脂聯(lián)素重組體對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響 用質(zhì)量濃度為1～60μg/mL的脂聯(lián)素重組體處理SW-480細(xì)胞48h，MTT結(jié)果顯示，隨著脂聯(lián)素濃度的提高，細(xì)胞懸液的吸光度逐步下降。見(jiàn)圖2。通過(guò)計(jì)算測(cè)得脂聯(lián)素重組體對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率介于2.9%～37.6%之間。見(jiàn)圖3。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，當(dāng)濃度大于10μg/mL時(shí)，具有顯著性差異，能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用（P<0.01）。

2.3 脂聯(lián)素重組體對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480侵襲遷移能力的影響 用質(zhì)量濃度為1～60μg/mL的脂聯(lián)素重組體處理SW-480細(xì)胞24h，觀察細(xì)胞的侵襲劃線(xiàn)遷移情況。見(jiàn)圖4。并計(jì)算遷移率，結(jié)果顯示，隨脂聯(lián)素重組體質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)細(xì)胞的侵襲抑制增加，抑制率介于1.8%～42.0%，當(dāng)脂聯(lián)素濃度大于30μg/mL時(shí)，均表現(xiàn)出較為明顯的抑制腫瘤侵襲的作用。見(jiàn)圖5。

圖2 不同濃度脂聯(lián)素作用后的MTT結(jié)果

圖3 不同濃度脂聯(lián)素作用后對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響

圖4 不同濃度脂聯(lián)素作用后結(jié)腸癌細(xì)胞SW480劃線(xiàn)遷移結(jié)果

3 討論

圖5 不同濃度脂聯(lián)素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480劃線(xiàn)遷移結(jié)果

脂聯(lián)素在糖類(lèi)和脂類(lèi)代謝中起著重要的作用，與肥胖、胰島素抵抗等多種代謝性疾病相關(guān)，但隨著研究的深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)脂聯(lián)素水平的改變與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。關(guān)于脂聯(lián)素與癌癥之間的關(guān)系，目前的研究主要集中在臨床病例分析方面，脂聯(lián)素體外作用的研究相對(duì)較少。臨床研究顯示子宮肌瘤和子宮內(nèi)膜癌患者血清脂聯(lián)素水平明顯低于對(duì)照組[4,8]，也有研究顯示脂聯(lián)素可能與前列腺癌的侵襲性有關(guān)[9]，一些學(xué)者還發(fā)現(xiàn)血清脂聯(lián)素水平與乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)呈明顯的負(fù)相關(guān)[10-11]，在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌相關(guān)性研究中，也表現(xiàn)相同的趨勢(shì)[6-7]。體外實(shí)驗(yàn)顯示脂聯(lián)素可以抑制一些癌癥細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡，并對(duì)血管生成有抑制作用，從而阻斷細(xì)胞的遷移。Bub等[12]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)脂聯(lián)素復(fù)合物明顯抑制了前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Kang等[13]驗(yàn)證生理濃度的脂聯(lián)素可以明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞系細(xì)胞的增殖，甚至引起細(xì)胞的凋亡。重組脂聯(lián)素和及其基因的過(guò)表達(dá)明顯地減少了MDA-MB-231細(xì)胞系雌性裸鼠的乳腺腫瘤形成[14]。Brakenhielm等[15]發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可明顯抑制了雞胚尿囊膜和小鼠角膜中的新生血管形成，在荷瘤小鼠模型中，脂聯(lián)素通過(guò)減少瘤內(nèi)新生血管形成造成腫瘤細(xì)胞凋亡，顯著抑制了小鼠原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，脂聯(lián)素可能通過(guò)誘導(dǎo)新生血管生成及其他相關(guān)的基因的表達(dá)來(lái)影響腫瘤的生長(zhǎng)與遷移。

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界上許多地區(qū)還呈逐年上升趨勢(shì)。病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)系統(tǒng)中低水平的脂聯(lián)素與男性結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[16]，脂聯(lián)素缺乏的小鼠腹腔注射脂聯(lián)素可以抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖，而且球型脂聯(lián)素比長(zhǎng)鏈型的作用更加明顯。另外結(jié)腸癌組織中adipoR1和adipoR2陽(yáng)性表達(dá)率分別達(dá)95%和88%。

目前，有關(guān)脂聯(lián)素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及其分子機(jī)制的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-480中脂聯(lián)素受體基因的表達(dá)情況，并研究了脂聯(lián)素球形結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移以及凋亡的影響。通過(guò)RTPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)受體基因AdipoR1和AdipoR2在該細(xì)胞株中均有所表達(dá)，脂聯(lián)素球形結(jié)構(gòu)能夠有效地通過(guò)脂聯(lián)素受體作用于細(xì)胞，從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移產(chǎn)生影響。在隨后的MTT實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在高于10μg/mL的濃度下，SW-480細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞形態(tài)有所變化，出現(xiàn)收縮，結(jié)果顯示脂聯(lián)素球形結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。而遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在低于30μg/mL濃度的情況下，脂聯(lián)素對(duì)細(xì)胞增殖影響較小，而高于該濃度的條件下，隨著脂聯(lián)素濃度的增高，結(jié)腸癌遷移能力受到越來(lái)越大的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)脂聯(lián)素球形結(jié)構(gòu)域濃度達(dá)到一定程度時(shí)，能夠抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)和遷移，但脂聯(lián)素抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路尚不清楚,有待進(jìn)一步深入研究。

[1] Fruebis J,Tsao TS,Javorschi S,et al.Proteolytic cleavage product of 30kDa adipocyte complement related protein increases fatty acid oxidation in muscle and causes weight loss in mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(4):2005-2010.

[2] Yamauchi T,Kamon J,Ito Y,et al.Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetie metabolic effects[J]. Nature,2003,423(6941):762-769.

[3] Chen DC,Chung YF,Yeh YT,et al.Serum adiponectin and leptin levels in Taiwanese breast cancer patients[J].Cancer Lett,2006,237(1):109-114.

[4] Soliman PT,Wu D,Tortolero-Luna G,et al.Association between adiponectin,insulin resistance,and endometrial cancer[J]. Cancer,2006,106(11):2376-2381.

[5] Burton A,Martin RM,Holly J,et al.Associations of adiponectin and leptin with stage and grade of PSA-detected prostate cancer:the Protect study[J].Cancer Causes Control,2013,24(2):323-334.

[6] Otake S,Takeda H,Suzuki Y,et al.Association of visceral fat accumulation and plasma adiponectin with colorectal adenoma:evidence for participation of insulin resistance[J].Clin Cancer Res,2005,11 (10):3642-3646.

[7] Ishikawa M,Kitayama J,Kazama S,et al.Plasma adiponectin and gastric cancer[J].Clin Cancer Res,2005,11(2Pt 1):466-472.

[8] Chen HS,Chan TF,Chung YF,et al.Aberrant serum adiponectin levels in women with uterine leiomyomas[J].Gynecol Obstet Invest,2004,58(3):160-163.

[9] Freedland SJ,Sokoll LJ,Platz EA,et al.Association between serum adiponectin,and pathological stage and grade in men undergoing radical prostatectomy[J]. Urology,2005,174:1266-1270.

[10] Duggan C,Irwin ML,Xiao L,et al.Associations of insulin resistance and adiponectin with mortality in women with breast cancer[J].J Clin Oncol,2011,29(1):32-39.

[11] Maskarinec G,Woolcott C,Steude JS,et al.The relation of leptin and adiponectin with breast density among premenopausal women[J].Eur J Cancer Prev,2010,19(1):55-60.

[12] Bub JD,Miyazaki T,Iwamoto Y.Adiponectin as a growth inhibitor in prostate cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,340(4):1158-1166.

[13] Kang JH,Lee YY,Yu BY,et al.Adiponectin induces growth arrest and apoptosis of MDA-MB-231 breast cancer cell[J]. Arch Pharm Res,2005,28(11):1263-1269.

[14] Wang Y,Lam JB,Lam KS,et al.Adiponectin modulates theglycogen synthase kinase-3beta/beta-catenin signaling pathway and attenuates mammary tumorigenesis of MDA-MB-231 cells in nude mice[J].Cancer Res,2006,66(23):11462-11470.

[15] Br?kenhielm E,Veitonm?ki N,Cao R,et al.Adiponectin-induced antiangiogenesis and antitumor activity involve caspasemediated endothelial cell apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(8):2476-2481.

Objective To investigate the expression of adiponection receptor(adipoR) and the effects of recombinant adiponectin (gAd) on the proliferation and migration of human colon cancer cell line SW-480. Methods SW-480 cells were divided into control group and gAd(1, 10, 30, 45and 60μg/mL) treatment groups, the effect of gAd on proliferation of SW-480 cells was measured by MMT assay, the invasive and migration abilities were assayed by scratch test. Results The proliferating ability of the cell was inhibitied in a concentration-dependent manner, with the ranging from 2.9%-37.6%, the cell proliferation was dramatically inhibited when the concentration of gAd was higher than 10μg/mL (P<0.01); the migration were also inhibitied in a concentration-dependent manner, with the ranging from 1.8% - 42.0%, the migration ability of SW-480 cells were dramatically inhibited when the concentration of gAd was higher than 30μg/mL (P<0.01). Conclusion These results indicate that the adiponectin dramatically inhibited the proliferation and migration of colon tumor cell when its concentration is >10μg/mL．

Adiponection; Colon cancer cells; Adiponection receptor; Migration; Metastasis

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.24.001

河南 462002 漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部 （王福青 周偉赫欣）