段亞彤 任麗萍 韓悅

遼寧省脊髓灰質(zhì)炎實驗室細(xì)胞敏感性實驗方法的建立與應(yīng)用

段亞彤 任麗萍 韓悅

目的 制備遼寧省疾病預(yù)防控制中心脊髓灰質(zhì)炎(脊灰)實驗室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)毒株(QC),評價遼寧省脊灰實驗室所用細(xì)胞系對脊灰病毒的敏感性,為脊灰實驗室常規(guī)監(jiān)測工作提供可靠質(zhì)量保證。方法 采用96孔微量培養(yǎng)板滴定法。結(jié)果 遼寧省脊灰實驗室2013年制備的QC 3次獨立的細(xì)胞敏感性實驗結(jié)果的滴度波動在±0.5 log 10 CCID50以內(nèi)，同時用中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家脊灰實驗室提供的已知滴度的Sabin參考株(CSTRS)做平行對照，CSTRS原始株3次滴度結(jié)果與其本身提供的參考值相比較，其滴度波動均在±0.5 log 10 CCID50范圍內(nèi)。開展的9次常規(guī)細(xì)胞系敏感性實驗，結(jié)果也均在正常范圍內(nèi)。結(jié)論 遼寧省脊灰實驗室QC結(jié)果符合實驗要求，遼寧省脊灰實驗室所用細(xì)胞系對脊灰病毒的敏感性未下降,是敏感、有效的。

脊髓灰質(zhì)炎病毒;細(xì)胞系敏感性實驗;質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)株（QC）

按照世界衛(wèi)生組織(WHO)要求，全球脊髓灰質(zhì)炎(脊灰)實驗室網(wǎng)絡(luò)應(yīng)開展細(xì)胞系敏感性實驗，以保持病毒分離過程中的高度敏感性，維持實驗室網(wǎng)絡(luò)的高質(zhì)量運(yùn)轉(zhuǎn)[1]。遼寧省脊灰實驗室按照國家脊灰實驗室要求逐步將細(xì)胞敏感性監(jiān)測納入常規(guī)監(jiān)測內(nèi)容，2013年重新制備了我省脊灰實驗室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)毒株（QC），用于RD(來源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞)、L 20 B(來源于轉(zhuǎn)基因小鼠肺細(xì)胞，表達(dá)了人類脊灰受體)細(xì)胞系細(xì)胞敏感性評價。

1 材料與方法

1.1 毒株的選擇 標(biāo)準(zhǔn)Sabin脊灰病毒參考株由國家脊灰實驗室提供,每管0.8 mL,低溫運(yùn)輸,-80℃保存。

1.2 細(xì)胞 無支原體污染的合格RD及L 20 B細(xì)胞系由國家脊灰實驗室提供。

1.3 實驗方法 采用96孔微量培養(yǎng)板滴定法。

1.3.1 制備遼寧省脊灰實驗室質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)毒株。

(1)檢查細(xì)胞質(zhì)量，通過視覺確定有無污染，將長滿單層健康的RD及L 20 B細(xì)胞（傳代后至少培養(yǎng)了2 d）換維持液并標(biāo)記。

(2)在生物安全柜中進(jìn)行操作，每次只能操作1種血清型的病毒。先將1管CSTRS脊灰病毒參考株用無菌吸管混勻，吸一半內(nèi)容物(約0.4 mL)接種于準(zhǔn)備好的RD細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，剩下的一半接種于準(zhǔn)備好的L 20 B細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種后的培養(yǎng)瓶置于36℃恒溫培養(yǎng)。

(3)逐日觀察并記錄細(xì)胞病變(CPE)。當(dāng)75%～100%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，將培養(yǎng)瓶反復(fù)凍融3次（解凍時搖動細(xì)胞瓶以確保所有細(xì)胞都能從瓶壁上脫落下來）。

(4)在生物安全柜中，用10 mL無菌吸管混勻培養(yǎng)瓶中的內(nèi)容物，并吸至標(biāo)記好的50 mL無菌離心管中。確保離心機(jī)蓋子和離心杯密封好后，將其置于冷凍離心機(jī)中(3000 rpm／min)，離心20 min。

(5)每個保存管標(biāo)記好所用的細(xì)胞名稱、制備的病毒型別和凍存日期等。在生物安全柜中，將上清液每管0.1 mL分裝在標(biāo)記好的保存管中。

(6)將保存管凍存于指定的用于保存感染性物質(zhì)的-80℃冰箱，作為遼寧省脊灰實驗室質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)毒株（QC）。

1.3.2 細(xì)胞系敏感性實驗 按照《脊髓灰質(zhì)炎手冊》的方法和要求進(jìn)行[2],通過Karber公式計算病毒滴度[3-5]。

1.3.3 QC滴度確定 制備的QC進(jìn)行了3次獨立的滴度水平測定,同時用CSTRS參考標(biāo)準(zhǔn)株作平行實驗，要保證有100%CPE及＜10%CPE出現(xiàn)的稀釋度。CSTRS參考株3次滴度結(jié)果與其本身提供的參考值相比較,其滴度波動均在±0.5 log 10 CCID50以內(nèi)，QC的滴度要高于CSTRS參考標(biāo)準(zhǔn)株,且3次QC實驗結(jié)果的滴度波動不超過±0.5 log 10 CCID50，表明QC滴度結(jié)果有效。如符合上述要求，取3次QC滴度結(jié)果的平均值做為QC標(biāo)準(zhǔn)值。

1.3.4 細(xì)胞支原體檢測 應(yīng)用PCR法檢測細(xì)胞系支原體，引物由國家脊灰實驗室提供；核酸提取試劑盒:QIAGEN RNeasy Mini Kit；擴(kuò)增條件：94℃3 min；94℃30 s、50℃30 s、72℃1 min 20 s，35個循環(huán)；72℃10 min。

2 結(jié)果

2.1 CSTRS參考標(biāo)準(zhǔn)株滴度 SabinI：在RD細(xì)胞上為5.00log10CCID50/0.1mL，在L20B細(xì)胞上為4.78log 10CCID50/ 0.1mL。SabinII：在RD細(xì)胞上為5.00log10CCID50/0.1mL，在L 20B細(xì)胞上為4.82log10CCID50/0.1mL。SabinIII：在RD細(xì)胞上為5.00log10 CCID50/0.1mL，在L20B細(xì)胞上為4.77log 10CCID50/0.1mL。見表1。

2.2 遼寧省脊灰實驗室QC滴度參考值 SabinI：在RD細(xì)胞上為8.33 log 10 CCID50/0.1 mL，在L 20 B細(xì)胞上為7.95 log 10 CCID50/0.1 mL。SabinII：在RD細(xì)胞為8.17 log 10 CCID50/0.1 mL，在L 20 B細(xì)胞上為8.07 log 10 CCID50/ 0.1 mL。SabinIII：在RD細(xì)胞上為8.53 log 10 CCID50/0.1 mL，在L 20 B細(xì)胞上為7.38 log 10 CCID50／0.1 mL。見表2。

表1 QC滴度確定

表2 實驗用細(xì)胞代數(shù)

2.3 3L 20 B及RD細(xì)胞的支原體檢測和細(xì)胞敏感性實驗2013年4月～到2015年8月共進(jìn)行9次細(xì)胞敏感性實驗，實驗結(jié)果均在合格范圍內(nèi)，支原體檢測均為陰性。見表3。

3 討論

雖然我國自2000年證實無脊灰狀態(tài)，但仍面臨野毒輸入的風(fēng)險[6-7]。按照衛(wèi)生部和國家脊灰實驗室要求，脊灰病毒實驗室檢測與結(jié)果報告的時限由原來的28天縮短為14天,因此使用高敏感的細(xì)胞系對脊灰病毒分離尤為重要。細(xì)胞是病毒分離的工具,支原體污染細(xì)胞后通過多種機(jī)制影響細(xì)胞的生長,從而影響細(xì)胞的敏感性[8]。遼寧省脊灰實驗室逐步將細(xì)胞敏感性實驗納入了常規(guī)監(jiān)測中，2013年制備了新一批本實驗室的QC并同時開展了細(xì)胞系的支原體檢測，實驗結(jié)果顯示用CSTRS參考標(biāo)準(zhǔn)株做平行實驗，3次實驗結(jié)果滴度均波動在±0.5 log 10 CCID50范圍內(nèi)，QC的滴度高于CSTRS參考標(biāo)準(zhǔn)株,3次QC實驗結(jié)果的滴度波動均在±0.5 log 10 CCID50范圍內(nèi)，因此可以確定本實驗室QC滴度結(jié)果的有效性，取3次QC滴度的平均值做為遼寧省脊灰實驗室QC標(biāo)準(zhǔn)值。制定并確定遼寧省脊灰實驗室QC滴度后做的9次細(xì)胞敏感性實驗結(jié)果均在正常范圍內(nèi)且通過PCR法對RD和L 20 B細(xì)胞的支原體檢測均為陰性，表明遼寧省脊灰實驗室所使用的細(xì)胞對脊灰病毒保持著正常的敏感性，為遼寧省脊灰實驗室的監(jiān)測工作提供了可靠的技術(shù)保障。

表3 支原體檢測及細(xì)胞敏感性實驗結(jié)果

[1] 王東艷，趙蓉，安洪秋.脊髓灰質(zhì)炎病毒細(xì)胞系敏感性實驗方法的建立[J].中國計劃免疫,2005,11(6)：431-434．

[2] 世界衛(wèi)生組織．脊髓灰質(zhì)炎手冊[M]．4版．北京：人民衛(wèi)生出版社,2004：71-77．

[3] 冷紅英，吳 昀，胡瑩.江蘇省脊髓灰質(zhì)炎實驗室細(xì)胞系敏感性實驗方法的建立和監(jiān)測[J].中國初級衛(wèi)生保健,2014,28(1):77-78.

[4] 陳玫，宋慧軍，郭玉.河北省脊髓灰質(zhì)炎實驗室細(xì)胞系敏感性實驗方法的建立[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志,2006,22(3）:267-269.

[5] 陳玫，趙娜，張俊棉.2006-2011年河北省脊髓灰質(zhì)炎實驗室細(xì)胞敏感性監(jiān)測結(jié)果分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志,2013,29(7):569-571.

[6] 汪海波，羅會明，溫寧.全球脊髓灰質(zhì)炎流行情況分析及對我國防范脊髓灰質(zhì)炎野病毒輸入對策的啟示[J].中國疫苗和免疫, 2012,18(1):81-85.

[7] 張肖肖，路明，霞馬.河南省脊髓灰質(zhì)炎野病毒輸入與傳播風(fēng)險評估[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012,18(26):155-158.

[8] 嚴(yán)冬梅,張勇,王東艷.淺析支原體污染對非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒分離率的影響[J].中國計劃免疫,2004,10(6)：329-332．

Objective To prepare the quality control standard strain (QC) of Liaoning Provincial polio laboratory(LNPPL), to evaluate the sensitivity of the cell line to the polio virus in LNPPL, and to provide reliable quality assurance for the routine monitoring of the polio laboratory. Methods 96-microwells plate'S culture and titration was used. Results In the Qc of LNPPL,the fluctuation of titre was±0．.5 log 10 CCID50in 3 independent cellular sensitivity tests．At the sametime, China Sabin Test Reference Strain(CSTRS)provided by the National Polio Laboratory in viral disease control and preventionstation in the National CDC was used as parallel contrast．The fluctuation of titre were also±0．5 log 10 CCID50in 3 independent cellularsensitivity test comparing with its own standard provided by CSTRS．The results were also within the normal range of 9 conventional cell line sensitivity test. Conclusion The result of Qc in LNPPL was in accordance withexperimental requirement．And the sensitivity of the cell line to poliovirus used in LNPPL was not dropping，which was sensitive andefective．

Polio virus; Cell line sensitivity test; Quality control standard strain (QC)

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.36.006

遼寧 110005 遼寧省疾病預(yù)防控制中心免疫規(guī)劃所（段亞彤 任麗萍 韓悅）