楊楊 孟誼 樊祥山 錢曉萍 劉寶瑞 王立峰#

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院1腫瘤中心，2病理科，南京210008

HER2、COX-2在非小細胞肺癌中的表達意義△

楊楊1孟誼1樊祥山2錢曉萍1劉寶瑞1王立峰1#

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院1腫瘤中心，2病理科，南京210008

目的 探討人表皮生長因子受體2（human epidermal grow th factor receptor 2，HER2）和環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表達，其各自與臨床特征之間的關(guān)系及二者在NSCLC中表達的相互關(guān)系。方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法檢測72例NSCLC中HER2、COX-2的表達情況。結(jié)果 ①72例NSCLC中，HER2、COX-2的陽性表達率分別為55.6%、65.3%；②HER2在NSCLC中的陽性表達與組織學類型、分化程度、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、吸煙、病變部位無關(guān)（P＞0.05）；③COX-2的陽性表達與年齡、組織學類型、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)（P＜0.05），而與性別、吸煙、病變部位及分化程度無關(guān)（P＞0.05）；④HER2、COX-2在NSCLC中的陽性表達呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論 HER2、COX-2可以作為判斷NSCLC惡性程度的生物學指標。

人表皮生長因子受體2；環(huán)氧化酶2；非小細胞肺癌

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院病理科2010至2011年手術(shù)后經(jīng)病理學確診為NSCLC的石蠟包埋塊72例，患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。72例NSCLC患者中，男性49例，女性23例；吸煙50例，不吸煙22例；年齡42～73歲，≤60歲27例，＞60歲45例，平均63.83歲；中央型肺癌39例，周圍型肺癌33例；按照WHO組織學分類、分級、分期，腺癌35例，鱗癌37例；低分化43例，中高分化29例；腫塊＞3 cm者41例，≤3 cm者31例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例；Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期51例。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人HER2單克隆抗體、兔抗人COX-2多克隆抗體、超敏SP法免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鹽抗原修復液和磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2.2 標本處理 所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，常規(guī)于60℃溫箱烘烤2～3 h，撈片后置于60℃烤箱干燥24 h，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫組織化學分析 72例NSCLC組織均行免疫組化染色。標本常規(guī)方法脫蠟、水化，其他步驟按免疫組化SP法試劑盒說明書要求進行。采用已知陽性表達的癌組織做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.4 陽性結(jié)果判斷標準 HER2和COX-2免疫組化染色結(jié)果均由兩名病理科醫(yī)師共同評估得出。HER2陽性表達定位于腫瘤細胞的細胞膜上，判斷標準[5]：無著色或＜10%的細胞，有細胞膜著色為（－）；＞10%的細胞，有淡黃色膜著色為（+）；＞10%的細胞，有棕黃色膜著色為（++）；＞10%的細胞，有棕褐色膜著色為（+++）?！埃睘镠ER2表達陰性，“+～+++”為HER2陽性。

COX-2陽性表達定位于腫瘤細胞質(zhì)內(nèi)，采用染色指數(shù)法計算陽性結(jié)果，綜合考慮陽性細胞百分數(shù)和染色強度兩個方面[6]。按染色強度分為：腫瘤細胞不著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細胞數(shù)0～4%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；76%以上為4分。兩項相加后分為陰性和陽性：0～2分為陰性，3～7分為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

本研究應用SPSS17.0（SPSS Inc，Chicago，USA）統(tǒng)計軟件包分析，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HER2和COX-2在NSCLC中的表達

HER2陽性表達位于腫瘤細胞的細胞膜，COX-2陽性表達位于腫瘤細胞的細胞質(zhì)，二者均呈淡黃色至棕褐色顆粒。72例NSCLC中，HER2陽性40例，陽性率為55.6%；COX-2陽性47例，陽性率65.3%（圖1～2）。

2.2 HER2和COX-2的陽性表達與NSCLC臨床參數(shù)之間的關(guān)系

HER2在NSCLC中的陽性表達與組織學類型、分化程度、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、吸煙和病變部位無關(guān)（P＞0.05）。COX-2的陽性表達與年齡、組織學類型、分化程度、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)（P＜0.05），而與性別、吸煙、病變部位無關(guān)（P＞0.05），見表1。

表1 HER2和COX-2的表達與NSCLC患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 HER2、COX-2的陽性表達在NSCLC組織中的相關(guān)性

72例NSCLC患者中，HER2、COX-2同時陽性表達31例，同時為陰性表達者16例，HER2陽性表達而COX-2陰性表達者9例，COX-2陽性表達而HER2陰性表達者16例。χ2檢驗分析顯示，HER2與COX-2的表達具有正相關(guān)性（P＜0.001），見表2。

3 討論

表2 HER2、COX-2在NSCLC組織中表達的相互關(guān)系

HER2是一跨膜酪氨酸激酶受體，屬人表皮生長因子受體家族成員。近來研究發(fā)現(xiàn)，HER2是NSCLC重要的驅(qū)動突變之一[7]，可通過激活下游PI3K—AKT和MEK—ERK通路發(fā)揮驅(qū)動腫瘤增殖的作用：HER2與相應配體結(jié)合后，形成同/異源二聚體，激發(fā)受體中的酪氨酸激酶活性，致胞質(zhì)區(qū)的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、血管發(fā)生、黏附和運動性等[8]。HER2在正常情況下處于非激活狀態(tài)，當受到致癌因素的作用后被激活，使得細胞發(fā)生惡變，并通過促進腫瘤新生血管形成、下調(diào)α2β1整合蛋白表達等途徑促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[9]。既往文獻[8-11]報道，HER2在NSCLC中的陽性表達率為10%～60%，本研究中HER2在NSCLC中的陽性表達率為55.6%，同其類似。在NSCLC發(fā)生發(fā)展的早期及晚期事件中，HER2過表達均可作為負性因子參與其中[12-13]。最近一項研究證實，在淋巴結(jié)未受侵犯的NSCLC中，相較于未表達HER2的患者，表達HER2患者的病死率為前者的3.4倍（HR 3.41；P=0.017），表明HER2作為負性因子參與了NSCLC的早期事件[2]。另有一項Meta分析表明，HER2的過表達是肺癌尤其是早期NSCLC的負性預后因子[14]。本研究結(jié)果表明，HER2在腺癌組、低分化組中的陽性表達率明顯高于與之對應的組別。腫瘤病理類型及分化程度由細胞癌變過程的內(nèi)因所決定，屬腫瘤遺傳學范疇，是NSCLC發(fā)生，發(fā)展過程中的早期事件，故本研究結(jié)果亦表明HER2的過表達作為負性因子，參與NSCLC形成過程的早期事件。Chiang YY等[15]證實，HER2通過激活PI3K—AKT通路可降低凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）的表達，AIF是非依賴性細胞死亡過程中的重要因子，該因子的低表達可誘導NSCLC對化療藥物產(chǎn)生抵抗[16-17]，提示HER2的過表達與NSCLC化療抵抗有一定關(guān)系，并進一步支持了高表達HER2的NSCLC預后不良的結(jié)論。本研究證實HER2在腫塊＞3 cm組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期組中的陽性表達率明顯高于與之對應的組別，鑒于NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM的高分期是晚期NSCLC的重要特征，故本研究結(jié)果同樣支持HER2的過表達作為負性因子，涉及了NSCLC發(fā)生，發(fā)展過程的晚期事件。

COX-2又稱前列腺素過氧化物合成酶，是前列腺素合成過程中一個重要的限速酶，其可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化成前列腺素和血栓素，從而在機體的生理和病理過程中發(fā)揮作用。COX-2在正常組織中表達水平較低，但在細胞因子、癌基因及各種促癌因素的刺激下表達水平升高，參與腫瘤新生血管的生成、腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移[2,4]。本研究中COX-2在NSCLC中的陽性表達率為65.3%，與近期一項關(guān)于NSCLC患者COX-2表達水平Meta分析得出的結(jié)果63.6%[19]相類似。本研究不但進一步證實了COX-2在NSCLC中的高表達狀況，還證明了COX-2的陽性表達在年齡＞60歲、腺癌組、腫塊＞3 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期組中的陽性表達率明顯高于與之對應的組別，說明COX-2過表達在NSCLC中不但參與了腫瘤的發(fā)生與進展，還可能促進了癌細胞的生長和增殖，加速了癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，提示COX-2是NSCLC的負性預后因子。NSCLC中過表達的COX-2促進腫瘤發(fā)生的原因尚不明確，可能的主要機制包括促進腫瘤微血管生成和抑制凋亡[19-21]，通過前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）干擾EGFR通路[5]，影響肺癌生長及轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異性蛋白酶產(chǎn)量、促進淋巴管生成[22-23]。

研究中進一步分析HER2和COX-2表達的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者在NSCLC中的陽性表達呈明顯正相關(guān)，提示HER2與COX-2在NSCLC發(fā)生，發(fā)展中可能具有協(xié)同作用。具體機制目前尚不明確，由于HER2可通過激活PI3K—AKT通路降低AIF表達從而抑制凋亡；同時作為COX-2主要代謝產(chǎn)物的PGE2也能直接抑制凋亡并通過EGFR相關(guān)通路影響腫瘤生長，故推測HER2與COX-2可能是通過影響類同的信號通路而具有相互協(xié)同作用。研究證實HER2和COX-2產(chǎn)物PGE2均能刺激血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial grow th factor，VEGF）的合成，誘導免疫耐受、抑制凋亡從而增加腫瘤細胞的浸潤能力，表明二者可能同時涉及到相通甚至相同的信號通路，并具相互作用[24-25]。Benoit等[26]發(fā)現(xiàn)HER2可誘導COX-2的基因轉(zhuǎn)錄，COX-2及其產(chǎn)物PGE2的基因表達亦可提高HER2的基因表達。此外，COX-2的酶抑制劑可顯著降低HER2蛋白的表達，并可有效提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提示二者可能在轉(zhuǎn)錄水平上的某個正反饋環(huán)節(jié)上相互調(diào)節(jié)。

總之，HER2與COX-2的過度表達是NSCLC的不良預后因子，同時HER2與COX-2在NSCLC中的表達具有一定的相關(guān)性，可作為判斷NSCLC惡性程度的重要生物學指標，但其具體的相互協(xié)同作用促進NSCLC發(fā)生，發(fā)展的機制還有待進一步研究。

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Expression of HER2 and COX-2 in non-small cell lung cancer△

YANG Yang1MENG Yi1FAN Xiang-shan2QIAN Xiao-ping1LIU Bao-rui1WANG Li-feng1#
1
Comprehensive Cancer Center,2Departmentof Pathology,the A ffiliated Drum Tower Hospital,Medical Schoolof Nanjing University,Nanjing 2l0008,China

Objective To investigate the expression of HER2 and COX-2 in non-small cell lung cancer(NSCLC) and the association w ith patients'clinical characteristics.Method The protein expression of HER2 and COX-2 were detected in 72 NSCLC patients by immunohistochem istry w ith streptavidin-peroxidase(SP)methods.Result (1)The positive expression rate of HER2 and COX-2 were 55.6%and 65.3%,respectively.(2)The expression of HER2 was significantly correlated w ith histological type,differentiation,size of mass,lymph node metastasis and clinical stage (P＜0.05),while itwas not related w ith patients'sex,age,tumor site and smoking status(P＞0.05).(3)COX-2 expression was related to patients'age,histological type,mass size,lymph nodemetastasis and clinical stage(P＜0.05), but no significant correlation was found between COX-2 expression and patients'sex,smoking status,tumor site and differentiation(P＞0.05).(4)There was statistically positive correlation between expression of HER2 and COX-2.Conclusion Detection of HER2 and COX-2 can be used as indicators for prognosis in NSCLC.

HER2;COX-2;NSCLC

R734.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.05.16

Oncol Prog,2015,13(5)

根據(jù)最新的全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1]，肺癌 是全球范圍內(nèi)最易導致死亡的惡性腫瘤，且是數(shù)十年來最常見的惡性腫瘤之一。2012年全球新發(fā)180萬例肺癌患者（占所有惡性腫瘤的12.9%），其中58%發(fā)生在發(fā)展中國家，每10萬例東亞人中就有50.4例肺癌患者。肺癌主要分為兩種類型：非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）（約占85%）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）（約占15%），深入研究NSCLC的分子生物學特征對其診斷、治療和預后改善都具有極其重要的意義。HER2和COX-2蛋白在NSCLC中呈上調(diào)表達，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。HER2是一跨膜酪氨酸激酶受體，屬表皮生長因子受體（epidermal grow th factor receptor，EGFR）家族，通過激活下游PI3K—AKT和MEK—ERK通路發(fā)揮驅(qū)動腫瘤增殖的作用；COX-2是前列腺素合成過程中的重要限速酶，其表達水平在正常組織中較低，但在細胞因子、癌基因及各種促癌因素的刺激下升高并促進腫瘤生長[2，4]。本文通過檢測HER2和COX-2在NSCLC中的表達情況及二者之間的相關(guān)性，探討HER2和COX-2在NSCLC發(fā)生，發(fā)展中的作用及臨床意義。

江蘇省衛(wèi)生科研項目（H201235）；南京市醫(yī)學重點科技發(fā)展項目（2KX 12012）#

（corresponding author），e-mail：lifengwang@nju.edu.cn

2014-12-31