譙明 彭艷 楊漢兵 雷振富 王俊英 彭雪剛 文剛

AQP4及AQP4 mRNA在重型腦損傷中腦脊液中的表達(dá)及意義

譙明 彭艷 楊漢兵 雷振富 王俊英 彭雪剛 文剛

目的 觀察重型腦損傷后腦脊液中水通道蛋白4（AQP4）及AQP4 mRNA的表達(dá)變化及意義。方法 選取重型顱腦損傷患者51例，對(duì)每例患者第0、3、7天腦脊液進(jìn)行AQP4 ELISA（酶聯(lián)反應(yīng)吸附實(shí)驗(yàn)）含量測(cè)定，RT-PCR（實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）測(cè)定AQP4 mRNA表達(dá)。結(jié)果 第0、3、7天腦脊液中均可檢測(cè)AQP4及AQP4 mRNA。第3天較第0天升高（P＜0.05），第7天較第3天降低（P＜0.05），第7天與第0天比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AQP4與AQP4mRNA相關(guān)（r=0.867）。結(jié)論 重型腦損傷后患者腦脊液AQP4的表達(dá)隨著病程變化，推測(cè)AQP4可能參與了腦損傷的病理過(guò)程，與病情的轉(zhuǎn)歸相關(guān)。

重型腦損傷；水通道蛋白4

水通道蛋白（aquaporins）有一個(gè)六跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域和共有天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸基序，它構(gòu)成了孔的一部分，在動(dòng)植物及微生物細(xì)胞中廣泛分部的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與水通透性相關(guān)。1988年，Agre在分離紅細(xì)胞Rh蛋白時(shí)首先發(fā)現(xiàn)一種具有選擇性水通透的功能，分子量為28kD的蛋白，隨后被命名為AQP1[1]，至今在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白家族。其中在腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)6種水通道蛋白，其中AQP4是腦內(nèi)最重要、分布最廣的水通道蛋白，證明參與調(diào)控腦組織中水的沿滲透梯度由低滲向高滲移動(dòng)[2]，與腦損傷后腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)[3]。但現(xiàn)有研究均著重于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)人體的直接研究較少。本研究觀察重型腦損傷后腦脊液中AQP4及AQP4 mRNA的表達(dá)變化及意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年7月～2014年12月四川省仁壽縣人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的重型顱腦損傷患者51例，GCS（格拉斯哥昏迷指數(shù)）評(píng)分4～8分，年齡23～73歲，平均（45±15）歲，其中男28例，女23例，其中4例患者于3d內(nèi)死亡。受傷至手術(shù)時(shí)間0.5～3h。每例均行3次APECHEⅡ（急性生理與慢性健康評(píng)分）評(píng)分，均在10～25分，并行頭顱CT掃描確定顱內(nèi)不同區(qū)域腦損傷。

1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀：Ganthos 2010型。低速離心機(jī)：北京白楊醫(yī)療公司BY-160C型。PCR機(jī)：中山大學(xué)達(dá)安基因Da-7600型。低溫冰箱：海爾公司醫(yī)用低溫保存箱DW-40LS08型。

1.3 主要試劑 人AQP4酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒，廈門慧嘉生物科技有限公司。引物、內(nèi)參及熒光PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）體系由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)和合成。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 收集每例患者第0、3、7天腦脊液并進(jìn)行

AQP4及AQP4 mRNA含量測(cè)定：

（1）術(shù)后第0、3、7天抽取腦脊液，并3000r/min離心后取上清液置予凍存管于-20℃冰箱保存。

（2）待標(biāo)本收集完成后，一次性在本院檢驗(yàn)科免疫室行

ELISA檢測(cè)AQP4蛋白含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。

（3）RT-PCR（實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）測(cè)定AQP4 mRNA的表達(dá)。

①先提取的DNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA放-20℃冰箱保存。

②標(biāo)本收集完全后行熒光定量PCR反應(yīng)(SYBR Green I嵌合熒光法)測(cè)AQP4 mRNA的表達(dá)。按如下步驟進(jìn)行。

1）由TaKaRa公司設(shè)計(jì)和合成人AQP4引物及內(nèi)參照β-actin引物序列：

AQP4：上游5,-CGCGACTCCCAGCACATGAGAGC TGCACTCTGGCTGGGATAA-3,下游5,-GTCCTAAGC TTGTGAAAAATAAACATTTTGGATAAC-3。PCR產(chǎn)物：6216 bp。

β-actin：上游5,-CATCCGTATAGCGTCGTCAAGAC CTCTATGCCAAC-3,；下游5,-ATGGAGCCTAGCCTGCC GCGAACCGATCCACA-3。PCR產(chǎn)物：620 bp。

2）以CDNA 3L，總15L規(guī)格給予逆轉(zhuǎn)錄成mRNA，其中予1個(gè)循環(huán)95℃3分鐘預(yù)變性；40個(gè)循環(huán)95℃10秒變性，63.1℃30秒退火；再予80個(gè)循環(huán)55℃10秒融解。由RT-PCR機(jī)自動(dòng)得出Ct值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用“x±s”表示，兩樣本均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

每例樣本反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算并讀出定量結(jié)果Ct值(threshold cycle)。采用Ct值。2-△△Ct法(△Ct＝Ctβ-actin－CtMuc5ac)進(jìn)行相對(duì)定量。從以上腦脊液AQP4和β-actin擴(kuò)增曲線圖和融解曲線圖可以看出(各標(biāo)本均有擴(kuò)增，且擴(kuò)增效率高。各標(biāo)本融解曲線無(wú)二聚體及非特異擴(kuò)增峰，肺組織各峰值基本一致，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)合理，特異性高。見(jiàn)圖1～圖4。

圖1 β-actin擴(kuò)增曲線圖

圖2 β-actin融解曲線圖

圖3 腦脊液AQP4擴(kuò)增曲線圖

圖4 腦脊液AQP4融解曲線圖

腦脊液中AQP4蛋白及mRNA表達(dá)從第0天開(kāi)始就升高，在第3天到高峰，第7天下降至正常水平。腦脊液中AQP4蛋白及mRNA表達(dá)第3天比第0天明顯增高，而第7天與第0天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第7天比第3天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 腦脊液中AQP4蛋白表達(dá)（x±s）

3 討論

腦水腫是引起顱內(nèi)高壓并腦疝的危險(xiǎn)因素。研究表明，APQ4在顱內(nèi)鉀的穩(wěn)態(tài)中有重要的作用，并可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，參與血腦屏障（BBB）的破壞和釋放血管性水腫的趨化因子和細(xì)胞因子，由此AQP4的作用是水腫的形成和BBB破壞[4]。在腦出血大鼠模型中AQP4及AQP4 mRNA高表達(dá)[5]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，缺少AQP4的小鼠腦組織可增加25%的體積[6]。

目前臨床上常用甘露醇及呋塞米進(jìn)行脫水利尿降顱內(nèi)壓，研究表明小鼠腦損傷模型中，注射甘露醇組的腦水腫程度及AQP4 表達(dá)都不同程度地降低[7]，但在本臨床觀察中，所有的腦出血組患者均給予甘露醇或/和呋塞米，但是AQP4的蛋白含量均不受此影響，持續(xù)增高，直到第7天。由此說(shuō)明常規(guī)的脫水劑的應(yīng)用并不能減輕腦組織水腫，僅能通過(guò)減少細(xì)胞外的水分來(lái)緩解顱內(nèi)壓的增高，減輕顱內(nèi)壓的效果并不理想，并均可引起明顯的水電解質(zhì)紊亂，而引起相應(yīng)的并發(fā)癥，增加患者的治療時(shí)間及后遺癥發(fā)生。

由此，AQP4蛋白的表達(dá)上調(diào)與腦水腫的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)腦水腫給予抑制或拮抗AQP4蛋白的產(chǎn)生、表達(dá)可緩解腦水腫的表達(dá)[8-10]。另外，AQP4蛋白表達(dá)的高低與腦水腫的輕重程度密切聯(lián)系[11]。

本研究結(jié)果表明腦水腫從創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生開(kāi)始，第3天到高峰，持續(xù)到第7天，若有專門拮抗AQP4通道藥物給予關(guān)閉水通道，減少自由水進(jìn)入腦組織細(xì)胞內(nèi)，可有效緩解腦水腫，有利于神經(jīng)組織恢復(fù)和避免進(jìn)一步損傷加重。未來(lái)可通過(guò)監(jiān)測(cè)AQP4或AQP4 mRNA的水平來(lái)臨床評(píng)估腦水腫的病情及預(yù)后。

但本研究樣本量較少，具體的AQP4調(diào)控機(jī)制不明，對(duì)AQP-4的表達(dá)和調(diào)控的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的深入研究,可以在將來(lái)更好地調(diào)控AQP4的水平來(lái)控制腦水腫的發(fā)生、發(fā)展，并對(duì)藥物研制、臨床診斷提供新的思維更進(jìn)一步的研究明確。

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Objective To observe the change of aquaporin (AQP)4 and AQP4 mRNA level in the cerebrospinal fluid of patients with severe brain injury and its clinical significance. Methods There are 51 severe traumatic brain injury patients. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) was used to determine cerebrospinal fluid AQP4 protein expression after 0,3,7 days，and RT-PCR (reverse transcription PCR) was used to determine AQP4 mRNA expression. Results AQP4 protein or mRNA expressed within the 0,3,7 days.The level of AQP4 or AQP4 mRNA increased 3 days after operation (P ＜0.05),and then statistically decreased 7 days after operation (P ＜0.05). But the 7 days had no statistically difference compared with 0 day after operation. Conclusion After Brain injury, AQP4 expression changes after brain injury is closely related with the formation of cerebral edema, AQP4 in the damage brain edema formation plays an important role.

Aevere brain injury; Aquaporin4

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.34.008

四川 620500 眉山市第二人民醫(yī)院（仁壽縣人民醫(yī)院）重癥醫(yī)學(xué)科 （譙明 彭艷 王俊英 彭雪剛 文剛） 眉山市第二人民醫(yī)院（仁壽縣人民醫(yī)院）神經(jīng)外科 （楊漢兵） 眉山市第二人民醫(yī)院（仁壽縣人民醫(yī)院）檢驗(yàn)科 （雷振富）

譙明 E-mail：qiaosong1980@163.com