王剛 李曉萍 王進

植入殼聚糖體內(nèi)降解的機理研究

王剛 李曉萍 王進

殼聚糖已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，但明確殼聚糖的降解機理是其應(yīng)用于人體植入的前提。殼聚糖是甲殼素脫乙酰化的產(chǎn)物，可通過酸降解法、氧化降解法和酶降解法降解，而植入人體后則通過溶菌酶水解成N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖。溶菌酶通過其活性部位與殼聚糖鏈中的乙酰氨基基團結(jié)合，在D、E環(huán)之間產(chǎn)生斷裂。因此，乙酰氨基基團的數(shù)量是植入殼聚糖水解的關(guān)鍵。

殼聚糖；降解；乙酰氨基；溶菌酶

殼聚糖[chitosan，(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖]是由甲殼素[chitin，(l,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖]經(jīng)脫乙?；磻?yīng)后而得到的一種生物高分子，廣泛存在于節(jié)肢動物如蝦、蟹的殼和真菌的細胞壁中，是一種再生資源。殼聚糖由于具有成膜性、生物兼容性好以及易于被生物降解等特點，在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。為了更清晰的評價殼聚糖在體內(nèi)的循環(huán)降解過程，本文對殼聚糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、降解方法和溶菌酶進行了介紹，并著重對殼聚糖的溶菌酶催化降解機理作一綜述。

1 殼聚糖結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

殼聚糖是白色、無定型、半透明、略有珍珠光澤的固體，因原料不同和制備方法不同，相對分子質(zhì)量也從數(shù)十萬至數(shù)百萬不等，它不溶于水和堿溶液，可溶于稀的鹽酸、硝酸等無機酸和醋酸等大多數(shù)有機酸，不溶于稀的硫酸、磷酸。

甲殼素和殼聚糖的結(jié)構(gòu)上見圖1和圖2，糖鏈上N-乙?；亩喙?，對它們的性質(zhì)具有重大影響。

圖1 甲殼素結(jié)構(gòu)式

圖2 殼聚糖結(jié)構(gòu)式

脫乙酰度越是低于70%的殼聚糖，在1%鹽酸中的溶解度越小，小到不溶解的，則就是甲殼素。因此，脫乙酰度是殼聚糖的主要性能指標(biāo)[1]。

2 殼聚糖的降解方法

在殼聚糖的各種改性反應(yīng)中，殼聚糖的降解反應(yīng)越來越受到廣泛的關(guān)注。因為降解后生成的殼低聚糖，特別是分子量低于一萬的低聚糖，表現(xiàn)出其獨特的生理活性和物化性質(zhì)。它可以提高巨噬細胞的吞噬功能，促進肝臟抗體的生長，抑制腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移[2]，可有效地降低肝臟和血清中的膽固醇[3]，相對分子量為1500的甲殼低聚糖對大腸桿菌有強的抑菌作用[4]，特別是較高聚合度的甲殼低聚糖具有阻礙病源菌生長繁殖的功能，可促進蛋白質(zhì)合成，活化植物細胞，從而促進植物快速生長等[5]。

殼聚糖的降解反應(yīng)大致分三種方法：酸降解法、氧化降解法和酶降解法。其中，酶解法應(yīng)用專一性殼聚糖酶和非專一性的其他酶來進行殼聚糖的降解，能用于酶解法的各種酶有30多種[6]，通過特異地開裂殼聚糖的β(l,4)糖苷鍵來達到降解目的，在整個降解過程中無其他反應(yīng)試劑加入、無其他反應(yīng)副產(chǎn)物生成，是殼聚糖降解的最理想方法。

3 溶菌酶

溶菌酶(lysozyme)，又稱細胞壁溶解酶(muramidase)，它是一種能夠水解微生物細胞壁肽聚糖的酶。在1922年，英國細菌學(xué)家Fleming首次在在人的眼淚及唾液中發(fā)現(xiàn)了這種酶[7]。溶菌酶是人體體液中含量較高的一種抗菌物質(zhì)，在淚液中含量最多，約占人體淚液蛋白含量的20%～40%。

溶菌酶的主要功能是通過破壞細菌細胞壁的肽聚糖骨架成分，從而水解細菌細胞壁，達到溶菌的作用。溶菌酶具有廣泛的抑菌譜，它能分解革蘭氏陽性菌、枯草桿菌及耐輻射微球菌等，并且效果很好。因為肽聚糖是這些細菌細胞壁的主要骨架成分，肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰細胞壁之間的β-1,4糖苷鍵是溶菌酶的專一作用位點。相同的，溶菌酶會破壞殼聚糖鏈中的β-1,4糖苷鍵，將殼聚糖水解成含N-乙?；咸烟呛桶被咸烟堑墓烟牵_到降解殼聚糖的作用。

4 殼聚糖降解產(chǎn)物及其功效

殼聚糖水解產(chǎn)物是N-乙酰氨基葡萄糖(2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose,GlcNAc)和氨基葡萄糖(2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose,GlcN)的多糖或寡糖。

4.1 抗腫瘤作用 李運曼[8]等采用抗移植性腫瘤實驗方法證實GlcN對小鼠移植肉瘤、肝痛腹水瘤和艾氏腹水實體瘤有顯著的抑制作用，尤其是對小鼠移植肉瘤和肝廟腹水瘤抑制作用最強。

4.2 誘導(dǎo)白血病細胞向巨噬細胞轉(zhuǎn)化作用 白血病通常由于造血干細胞在定向分化的過程中出現(xiàn)異常而發(fā)生，王哲[9]等分別用不同濃度GlcN和GlcNAc對白血病K562細胞進行誘導(dǎo)分化實驗，結(jié)果表明二者均可誘導(dǎo)K562細胞向巨噬細胞方向分化，表明兩藥均可以抑制防細胞增殖，很可能成為新的高效、低毒的髓系白血病治療候選藥物。

4.3 清除過氧化氫，抗衰老作用 目前發(fā)現(xiàn)氨基葡萄糖與Cu2+形成的配合物對H2O2的分解具有催化作用，邵健[10]等利用GlcN在水溶液中與Cu2+形成配合物，加入到一定濃度的H2O2中，在不同條件下放置，于不同時間測分解率。結(jié)果表明GlcN-Cu2+配合物對分解H2O2具有明顯的催化作用，在30℃及pH6.5條件下作用12h可使90%以上的H2O2分解，24h后分解幾乎完全。

4.4 治療骨關(guān)節(jié)炎作用 氨基葡萄糖是一種天然的氨基單糖，是軟骨基質(zhì)和滑液中聚氨基葡萄糖的成分。外源性的氨基葡萄糖可以刺激軟骨細胞合成蛋白多糖，補充軟骨基質(zhì)的丟失成分，并可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，從而促進軟骨的修復(fù)。氨基葡萄糖可以抑制因免疫而造成的蛋白多糖降解、修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨的作用；研究表明[11]，氨基葡萄糖可抑制彈性蛋白酶、溶酶體酶等水解醉的釋放，減少其對軟骨基質(zhì)的水解破壞，從而阻礙因免疫反應(yīng)的惡性循環(huán)對關(guān)節(jié)軟骨的不斷破壞。

5 殼聚糖降解機理

殼聚糖在植入人體后，主要倚靠體液中的溶菌酶催化降解成N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖的單糖或多糖，從而被人體吸收。目前，國內(nèi)外對于殼聚糖在溶菌酶中水解的基礎(chǔ)研究主要集中在日本，國內(nèi)較少。

5.1 殼聚糖產(chǎn)物的研究 為明確殼聚糖降解產(chǎn)物，Kenichi Ishiguro[12]采用1H核磁共振技術(shù)，測試GlcNAc、(GlcNAc)3和GlcN、(GlcN)3的單糖和三聚糖基準(zhǔn)物的圖譜。見圖3。

選用脫乙酰度66%、分子量約19100的殼聚糖在37℃的含有溶菌酶的醋酸緩沖液反應(yīng)6天的降解產(chǎn)物進行核磁共振測試，光譜見圖4。

圖4 殼聚糖水解產(chǎn)物的1H核磁譜圖

圖中，P(4.6ppm)和Q(4.90ppm)分別正好對應(yīng)上GlcNAc和GlcN的H-1(β)峰，峰值較小的X(5.17ppm)、Y(4.69ppm)正好對應(yīng)上GlcNAc和GlcN的H-1(α)，殼聚糖的產(chǎn)物的核磁共振峰與單糖和三聚糖的GlcNAc和GlcN一一對應(yīng)，而且峰值的大小也反應(yīng)出兩者的比例，從圖中計算出其脫乙酰度為53%，而通過紅外測試[13]其脫乙酰度為55%，幾乎一致。由此說明，殼聚糖產(chǎn)物的確為GlcNAc和GlcN的單糖或者寡糖。

5.2 溶菌酶的催化機理 為解釋溶菌酶的催化作用，1965年Johnson LN[14]實驗室用X射線晶體結(jié)構(gòu)分析法闡述了蛋清溶菌酶的三維立體結(jié)構(gòu)，通過他們的三維立體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)溶菌酶分子其實是一個大小為4.5nm×3.0nm×3.0nm的近橢圓形結(jié)構(gòu)。溶菌酶分子內(nèi)部幾乎是非極性的，在分子的表面有一個較深的裂縫，恰好能容納多糖底物的六個單糖（A、B、C、D、E和F環(huán)），這就是溶菌酶的活性部位，它是一個由肽鍵上的第35位的谷氨酸和第52位的天門冬氨酸構(gòu)成的活性中心，白色所示的即活性部位的Glu35和Asp52。見圖5。

圖3 GlcNAc(a)和GlcN(b) 的1H核磁譜圖

圖3 (a)中A、B峰為GlcNAc的H-1(α)和H-1(β)峰，C為H-1質(zhì)子共振峰。圖3(b)中D、E為GlcN的H-1 (α)和H-1(β)峰。GlcNAc和GlcN的核磁共振數(shù)據(jù)見表1。

圖5 溶菌酶三維結(jié)構(gòu)

表1 GlcNAc和GlcN的核磁共振數(shù)據(jù)

Pangburn[15]在進行溶菌酶水解殼聚糖實驗時發(fā)現(xiàn)不同濃度酶在催化水解時，水解超過2小時后低濃度酶的催化反應(yīng)速率成線性而高濃度酶為非線性，他認(rèn)為這種高濃度下呈現(xiàn)非線性催化的原因是在底物與溶菌酶活性部位結(jié)合導(dǎo)致的。直觀的，將溶菌酶中具有活性部分設(shè)計成模型[16]，如圖6所示，A-F為溶菌酶活性部位的6個環(huán)，它可與帶有乙酰氨基基團的線性聚合物相互作用。溶菌酶與底物結(jié)合時，第四個糖殘基D環(huán)由于空間的原因必須由正常的椅式變形為能量高的半椅式，因此降低了糖苷鍵的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其容易斷裂。

圖6 溶菌酶具有活性部位的示意圖

圖中，a為乙酰氨基基團，在D、E之間的箭頭表示N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)生斷裂的鏈段部位，即斷裂發(fā)生在D、E之間。在斷裂部位，a必須為乙酰氨基基團，否則其與溶菌酶的相互作用會減弱，無法使鏈段斷裂。

5.3 殼聚糖分子鏈段斷裂分析 為探索溶菌酶如何切斷殼聚糖中的線性鏈段，Kenichi Amano和Eiji Ito[17]水解自制脫乙酰度為68%的殼聚糖，水解條件為pH5.25的含有溶菌酶的醋酸銨緩沖液在37℃條件下反應(yīng)90h，然后將產(chǎn)物的各部分用色譜法分離[14]，并通過一定方法進行鑒別[18-21]，得到產(chǎn)物如表2所示。

表2 殼聚糖水解產(chǎn)物列表

本次實驗總共降解了86.4%的殼聚糖，其中C1、C2和C3為四聚糖，C4和C5為三聚糖，C6為二聚糖，分別對幾種寡糖繼續(xù)進行水解，結(jié)果如下：

GlcNAc-GlcNAc-GlcNAc-GlcN(C1)→GlcNAc+ GlcNAc-GlcNAc-GlcN(少)

GlcNAc-GlcNAc-GlcNAc-GlcN(C1)→(GlcNAc)2+ GlcNAc-GlcN(多)

GlcNAc-GlcN-GlcNAc-GlcNAc(C2)→GlcNAc-GlcN+(GlcNAc)2

GlcNAc-GlcN-GlcNAc-GlcN(C3)→GlcNAc-GlcN

GlcNAc-GlcNAc-GlcN(C4)→GlcNAc+GlcNAc-GlcN

C5、C6無法水解

(GlcNAc)3→GlcNAc+(GlcNAc)2

(GlcNAc)4→GlcNAc+(GlcNAc)2+(GlcNAc)3

從中可以看到，寡糖的水解是有條件的，不是所有的鏈段都可以斷裂，C5就是很好的例子，溶菌酶似乎對它無任何作用。

在200μL的pH5.25的醋酸緩沖液中加入600μg溶菌酶分別降解各種寡糖進行分析，從鏈段的斷裂情況中可以發(fā)現(xiàn)一定的規(guī)律。見表3。首先，E環(huán)必須和GlcNAc相結(jié)合，若與GlcN結(jié)合分子鏈段則不能斷裂；其次，C環(huán)和GlcN結(jié)合鏈段不能斷裂，當(dāng)C環(huán)無基團結(jié)合時，D環(huán)與GlcNAc結(jié)合時分子鏈段能斷裂，而與GlcN結(jié)合分子鏈段不能斷裂；最后，從反應(yīng)速率上看，C、D、E三環(huán)都與GlcNAc結(jié)合時反應(yīng)速率高，比如C1和(GlcNAc)3和(GlcNAc)4，而C環(huán)沒有和GlcNAc或者D部位與GlcN結(jié)合時，則反應(yīng)速率低，比如C2、C3和C4。C5不符合前面兩個規(guī)律，故而無法被繼續(xù)水解。由此可知，乙酰氨基基團與溶菌酶活性部位的結(jié)合是水解殼聚糖中的關(guān)鍵。另外，從C1的水解產(chǎn)物上看，C環(huán)與GlcNAc的結(jié)合使得分子鏈斷裂更容易發(fā)生，這跟C1兩種水解方式的產(chǎn)物對比上是一致的。

表3 寡糖水解速率及糖鏈段斷裂點

5.4 鏈段斷裂機理分析 從以上的實驗情況可知，殼聚糖被溶菌酶水解，是由其乙酰氨基基團與溶菌酶中的活性部位結(jié)合，在D環(huán)和E環(huán)之間斷裂導(dǎo)致的，水解產(chǎn)物為N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖的單糖或寡糖。因此，殼聚糖在生物體內(nèi)的降解，取決于GlcNAc含量，即乙酰氨基葡萄糖的多少。殼聚糖的脫乙酰度越高，分子鏈中GlcNAc比例就越低，與C、D、E環(huán)的結(jié)合概率就越低，線性分子鏈段越不易斷裂，進而導(dǎo)致殼聚糖越不容易被催化水解?？梢灶A(yù)見，幾乎完全由乙酰氨基葡萄糖組成的甲殼素在人體內(nèi)是很容易被溶菌酶水解的。但是，脫乙酰度的降低會又會降低殼聚糖的水溶性。因此，在作為人體的植入材料時，為同時保證殼聚糖的水溶性以及水解性，應(yīng)選擇的脫乙酰度在70%左右。脫乙酰度大于85%的殼聚糖難于在體內(nèi)被溶菌酶催化水解[22]。

5.5 殼聚糖降解產(chǎn)物在人體的代謝 殼聚糖在體內(nèi)被體液中的溶菌酶催化水解成N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖的單糖或寡糖，進而被人體吸收。國外以前對氨基葡萄糖的藥動力學(xué)研究都采用14C標(biāo)記法[23]，結(jié)果表明靜脈注射后血漿中的氨基葡萄糖放射活性很快消除，在給藥120h從尿中回收約28%，糞便回收＜1%。肌肉注射給藥的藥動力學(xué)參數(shù)與靜脈注射相似。

目前，氨基葡萄糖的藥動力學(xué)研究較為透徹：氨基葡萄糖在被人體吸收后，分布到組織和器官，尤其對關(guān)鍵軟骨有親和性，可彌散到關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)，到達軟骨細胞，在肝、腎、胃壁、小腸、腦、骨骼、肌肉和關(guān)節(jié)軟骨中均可測出氨基葡萄糖，且濃度依次遞增。氨基葡萄糖經(jīng)肝臟代謝為較小的分子，最終分解成二氧化碳、水和尿素，10%從尿液中排除，11%經(jīng)糞便排出，其余大部分以二氧化碳的形式經(jīng)呼氣道排出[24]。

6 展望

殼聚糖作為具有獨特性能的生物材料正越來越引起人們的廣泛關(guān)注，尤其在生物醫(yī)用方面。殼聚糖在植入人體后由體液中的溶菌酶水解成寡糖，被機體代謝吸收，并提高機體的免疫力。但是，殼聚糖的體內(nèi)水解要求其糖苷鍵中的乙酰氨基基團含量較高，脫乙酰度要求在85%以下，而目前國產(chǎn)的醫(yī)用級殼聚糖的脫乙酰度通常在90%以上，植入人體后可能將無法完全降解，這需要引起重視。另外，有關(guān)于溶菌酶水解殼聚糖后是單一產(chǎn)物還是多種寡糖的混合物有待于進一步研究。

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Chitosan has been widely used in the pharmaceutical industry, but the premise of its application in the human body is that the degradation mechanism must be clear. Chitosan is the partially deacetylated chitin，can be degraded by acid, oxidation and enzyme while it is degraded into 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose (GlcNAc) and 2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose (GlcN) by lysozyme in vivo. Cleavage of the chitosan linkage occurred between site D and site E by the acetyl amino groups bounded to the active sites of lysozyme. Therefore, the number of acetyl groups is the key to the hydrolysis of chitosan.

Chitosan; Degradation; Acetyl amino group; Lysoiyme

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.34.003

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