孫小強(qiáng)，劉揚(yáng)，陳亮，何浩明，李正義

（1 常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164；2 常州藥物研究所有限公司，江蘇 常州 213164）

透明質(zhì)酸（HA），又稱玻尿酸，是一種由兩個(gè)雙糖單位(1-β-3)葡糖醛酸及(1-β-3)N-乙?；?D-氨基葡糖重復(fù)連接而成的鏈狀多糖類生物高分子聚合物[1]，其相對(duì)分子質(zhì)量可達(dá)數(shù)百萬(wàn)。HA 因其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物相容性，已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、調(diào)節(jié)血管壁的通透性、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等[2-6]。研究表明，許多腫瘤和癌細(xì)胞表面上存在大量透明質(zhì)酸受體CD44 和RHAMM[7-8]，因此HA 可作為抗腫瘤藥物的靶向載體，應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng) 域[8-11]。先將藥物分子通過(guò)物理吸附、包裹或化學(xué)修飾的方法負(fù)載于HA，再通過(guò)HA 的靶向作用直達(dá)病灶，最后通過(guò)HA 的降解釋放藥物。一方面，可針對(duì)腫瘤細(xì)胞釋放抗癌藥物，提高藥物的利用率，增大療效；另一方面，可避免或降低藥物對(duì)其他非癌細(xì)胞的毒副作用[12]。但天然的HA 在人體內(nèi)易被透明質(zhì)酸酶降解而導(dǎo)致其停留時(shí)間短，實(shí)際利用率并不高。近年來(lái)，隨著高分子交聯(lián)技術(shù)的不斷發(fā)展，各種高分子量、抗降解的交聯(lián)HA 不斷涌現(xiàn)，進(jìn)一步提升了HA 的實(shí)用價(jià)值，同時(shí)也拓寬了其應(yīng)用范圍[13-15]。其中，縮水甘油醚交聯(lián)的HA 具有穩(wěn)定性高、生物相溶性好的特點(diǎn)，可用于眼睛玻璃體的替代物、術(shù)后防粘連、軟組織填充以及靶向藥物緩 釋的載體等[16]。因此，新型交聯(lián)HA 的開(kāi)發(fā)和應(yīng) 用已成為當(dāng)前科研工作者研究的重要方向和熱點(diǎn) 之一[17-19]。

阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA 的合成，抗瘤譜較廣，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用，臨床上用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞性白血病及各種實(shí)體性腫瘤白血病等的治療，是腫瘤化療方面最重要的藥物之 一[20-21]。目前，臨床上阿霉素的給藥方式主要是通過(guò)靜脈或動(dòng)脈注射，而這會(huì)隨之帶來(lái)許多毒副作用，如脫發(fā)、口腔潰瘍、食欲減退、惡心嘔吐、心臟毒性和骨髓抑制毒性等。其中早期心臟毒性表現(xiàn)為暫時(shí)性心電圖改變，多數(shù)可自行緩解，但晚期（慢性）心臟毒性，是不可逆的嚴(yán)重的心肌病變，嚴(yán)重者可致死，因此開(kāi)發(fā)新型的具有靶向作用的阿霉素給藥方式具有重要的應(yīng)用價(jià)值[21]。由于HA 可以識(shí)別多種腫瘤細(xì)胞，可將其作為腫瘤藥物的靶向載體用于抗腫瘤治療[22-25]。因此，本文選用抗腫瘤藥鹽酸阿霉素為藥物模型分子，嘗試制備具有適宜降解周期和釋藥性能的載藥交聯(lián)HA 膜，以期能用于中晚期癌癥患者手術(shù)后直接貼附于病灶，起到防粘連、降低毒副作用和高效治療的作用。

1.1 主要儀器和試劑

752 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；PHS-3C 型酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠；JSM-6360LA SEM，日本島津；透析袋，22mm× 34mm，截留相對(duì)分子質(zhì)量為14000，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

透明質(zhì)酸鈉干粉，常州藥物研究所有限公司；鹽酸阿霉素（DOX·HCl），上海灝云化工科技有限公司；透明質(zhì)酸酶（HAase），美國(guó)sigma Aldrich 化學(xué)品公司；其他試劑均為分析純化學(xué)試劑。

1.2 交聯(lián)透明質(zhì)酸的合成

將1g 透明質(zhì)酸鈉干粉分散在由20%的氫氧化鈉水溶液和丙酮組成的混合溶液后獲得透明質(zhì)酸鈉堿性混懸液，然后向透明質(zhì)酸鈉堿性混懸液中加入1.8g 交聯(lián)劑 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE），攪拌狀態(tài)下將反應(yīng)物料于50℃保溫8h，反應(yīng)結(jié)束后用濃鹽酸調(diào)節(jié)固液混合物料的pH 值至7，過(guò)濾洗滌后真空干燥得交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉粉末，用規(guī)格200 目的粉末過(guò)篩后，將過(guò)篩的粉末收集，依次用去離子水和 PBS 純化，再冷凍干燥后得交聯(lián)HA。

1.3 載藥交聯(lián)透明質(zhì)酸的制備

配制濃度為0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL 的鹽酸阿霉素水溶液，分別取3mL 分3次加入至30mg 交聯(lián)透明質(zhì)酸中，磁力攪拌至HA充分溶脹4h，-40℃冷凍干燥12h 后得到蓬松的海綿狀固體，碾壓后制成載藥量分別為1%、2%、4%和8%的載藥交聯(lián)HA 膜。

1.4 鹽酸阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取1.125mg 鹽酸阿霉素置25mL 容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，配成45μg/mL 的貯備液。再用蒸餾水分別稀釋成1μg/mL、6μg/mL、15μg/mL、30μg/mL 的系列濃度溶液。采用熒光分光光度法測(cè)定對(duì)應(yīng)的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 體外藥物釋放

將不同載藥量（1%、2%、4%和8%）的30mg載藥交聯(lián)HA 膜置于透析袋中，并用5mL 釋放介質(zhì)（pH 值為7.4 的PBS 緩沖溶液）稀釋或加入濃度為10U/mL 的透明質(zhì)酸酶（HAase）溶液3.75mL 和1.25mL 釋放介質(zhì)，密閉透析袋后將其置于50mL 釋放介質(zhì)中。將該藥物釋放系統(tǒng)置于37℃恒溫水浴中，磁力攪拌，間隔一定時(shí)間取樣3mL，同時(shí)補(bǔ)加等量的新鮮釋放介質(zhì)。將所取樣液3mL 用10mL 容量瓶定容后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，推算出藥物累計(jì)釋放量。

2.1 交聯(lián)透明質(zhì)酸的合成

HA 是一種高分子的聚合物，是由單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高級(jí)多糖，而D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之間由β-1,3-配糖鍵相連，雙糖單位之間由β-1,4-配糖鍵相連。如圖1 所示，HA 結(jié)構(gòu)中主要的修飾（反應(yīng)活性）位點(diǎn)是羧基和羥基，因此交聯(lián)劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE）與HA 在強(qiáng)堿作用下主要發(fā)生羧基、羥基與環(huán)氧乙烷之間的開(kāi)環(huán)反應(yīng)生成對(duì)應(yīng)的酯和醚，此外HA 分子內(nèi)或分子間的羧基與羥基之間也可發(fā)生酯化反應(yīng)形成內(nèi)部酯化的衍生物，最終將HA 橋連形成網(wǎng)狀的交聯(lián)HA 高聚物。

圖1 交聯(lián)HA 的合成

2.2 交聯(lián)透明質(zhì)酸的載藥性能

將交聯(lián)HA 固體置于一定濃度的鹽酸阿霉素水溶液中充分溶脹形成水凝膠，再用冷凍干燥方法對(duì)水凝膠進(jìn)行干燥、碾壓成形，即可得到負(fù)載鹽酸阿霉素的交聯(lián)透明質(zhì)酸膜。如圖2(a)和圖2(b)所示，載藥前交聯(lián)透明質(zhì)酸為白色薄膜，載藥后變?yōu)榧t色薄膜且顏色分布均勻，表明交聯(lián)透明質(zhì)酸與鹽酸阿霉素形成了結(jié)構(gòu)均勻的復(fù)合物。為進(jìn)一步探索該復(fù)合物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，采用SEM 觀測(cè)其截面的形貌。如圖2(c)和圖2(d)所示，交聯(lián)HA 載藥前表面均勻、光滑、致密，而載藥后表面變得稀疏、粗糙不平，這正是吸附鹽酸阿霉素的結(jié)果。此外，兩者均呈現(xiàn)了多孔的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這是由于交聯(lián)HA 在溶脹形成水凝膠的過(guò)程中，如同海綿一樣會(huì)吸附大量的水，從而在冷凍過(guò)程中內(nèi)部會(huì)形成大量的冰結(jié)晶，而這些冰晶在干燥過(guò)程中被抽走形成孔洞。

圖2 交聯(lián)HA 載藥前后的形貌對(duì)比

2.3 鹽酸阿霉素的體外釋放

2.3.1 鹽酸阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

紫外UV-Vis 吸收光譜（圖3）表明鹽酸阿霉素藥液的最大吸收峰在480 nm 處，在此波長(zhǎng)下是以質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），將數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析得到方程如式（1）。

圖3 鹽酸阿霉素的紫外吸收光譜圖

圖4 鹽酸阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表明鹽酸阿霉素質(zhì)量濃度在1～45mg/L 范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，可以用來(lái)檢測(cè)鹽酸阿霉素含量。

2.3.2 載藥交聯(lián)透明質(zhì)酸的體外釋放

模擬人體環(huán)境，將載有鹽酸阿霉素的交聯(lián)HA膜置于釋放介質(zhì)（pH 值為7.4 的PBS 緩沖溶液）中，37℃下考察不同載藥量（1%，2%，4%，8%）的交聯(lián)HA 膜的體外釋藥性能。圖5 為不同載藥量的交聯(lián)HA 膜24h 內(nèi)的藥物累計(jì)釋放曲線。首先，各組載藥交聯(lián)HA 在12h 內(nèi)，鹽酸阿霉素累積釋藥速率都隨時(shí)間急劇上升，隨后藥物的釋放趨于平緩。這是由于在藥物釋放初期膜表面和淺層的鹽酸阿霉素易與釋放介質(zhì)接觸，容易擴(kuò)散到溶液中，但隨著交聯(lián)HA 的不斷溶脹形成凝膠，此時(shí)凝膠內(nèi)外的介質(zhì)交換變得困難，導(dǎo)致膜內(nèi)部的鹽酸阿霉素不易溶出，即藥物的釋放速度較慢。其次，12h 后藥物的釋放趨于平緩且載藥量和累積釋藥速率呈反比，這可能是由于隨著載藥量的增加，載體表面和淺層分布的相對(duì)藥物量也隨之增加，從而增加了前期藥物的突釋和藥物的釋放速度，即凝膠外介質(zhì)中藥量相對(duì)較高，反而降低了交聯(lián)HA 凝膠體系內(nèi)外的濃度差，不利于后期凝膠內(nèi)部藥物向PBS 溶液中的擴(kuò)散，導(dǎo)致藥物的累積釋放速度降低。

當(dāng)交聯(lián)HA 不斷溶脹形成凝膠時(shí)，藥物的釋放速度逐漸變慢，此時(shí)藥物釋放的驅(qū)動(dòng)力主要是凝膠內(nèi)外的濃度差，因此采用不斷更新外部釋放介質(zhì)的方法，以保持較高的內(nèi)外濃度差，從而達(dá)到藥物快速釋放的效果。圖6 為每12h 更換釋放介質(zhì)與保持釋放介質(zhì)不變條件下載藥量為4%的交聯(lián)HA 的藥物釋放行為對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不斷更換釋放介質(zhì)時(shí)，其藥物釋放速度相對(duì)于不更換釋放介質(zhì)條件時(shí)明顯加快（72h，累積釋放率58% vs 31%）。

圖5 不同載藥量的交聯(lián)HA 藥物釋放曲線

圖6 釋放介質(zhì)對(duì)交聯(lián)HA (4%) 藥物釋放的影響

2.3.3 交聯(lián)HA 的降解對(duì)藥物緩釋性能的影響

為了進(jìn)一步探索交聯(lián)HA 的降解對(duì)藥物緩釋性能的影響，在上述體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)中加入透明質(zhì)酸酶（HAase）。圖7 為載藥量為4%的交聯(lián)HA 膜在有HAase和無(wú)HAase的條件下的藥物累積釋放曲線。結(jié)果表明，加入HAase 后載藥交聯(lián)HA 中的藥物釋放速度比無(wú)HAase 時(shí)明顯加快，12h 內(nèi)釋放藥物達(dá)61%，而此時(shí)無(wú)HAase 的載藥交聯(lián)HA 釋放藥物只有29%。這主要是由于HAase 可降解凝膠中的HA，不斷破壞凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使內(nèi)部的鹽酸阿霉素暴露在釋放介質(zhì)中，從而加快了藥物的釋放。但12h后，藥物釋放也趨于平緩，這是由于交聯(lián)HA 的降解速度也隨著反應(yīng)的進(jìn)行逐漸變慢。

圖7 有無(wú)HAase 時(shí)載藥量為4%的交聯(lián)HA 釋藥性能對(duì)比

3 結(jié) 論

以抗癌藥物鹽酸阿霉素為模型，交聯(lián)HA 為載體，通過(guò)溶脹作用吸附藥物分子，再冷凍干燥、碾壓成形，制備了一系列具有不同載藥量和一定緩釋效果的載藥交聯(lián)HA 膜。藥物體外釋放研究表明，交聯(lián)HA 膜中的鹽酸阿霉素的釋放速度同時(shí)受到釋放時(shí)間、載藥量和透明質(zhì)酸酶的影響。12h 內(nèi)藥物釋放較快，隨后釋放平緩，藥物累積釋放速度與載藥量呈反比。加入透明質(zhì)酸酶后，由于交聯(lián)HA 的不斷降解，藥物累積釋放速度比無(wú)透明質(zhì)酸酶時(shí)快。該研究為交聯(lián)HA 在藥物緩釋領(lǐng)域的應(yīng)用以及抗癌藥物鹽酸阿霉素的靶向給藥提供了新的思路和重要的參考依據(jù)。

[1] 凌沛學(xué)，賀艷麗，白若婉，等. 玻璃酸鈉結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生化藥物雜志，2000，21（3）：152-154.

[2] 陳建英，宋海波，賀艷麗，等. 交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠膜的制備及其生物相容性的研究[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程研究，2009，28（2）：104-107.

[3] 肖榮冬，翁國(guó)星．膠原/透明質(zhì)酸膜與明膠海綿支架材料力學(xué)及組織相容性的比較[J]. 中國(guó)組織工程研究，2012，16（25）：4637-4643.

[4] 范宏斌，胡蘊(yùn)玉，李旭升，等. 明膠-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸鈉作為組織工程軟骨支架的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2005，19（6）：473-477.

[5] Snyder T N，Madhavan K，Intrator M，et al. A fibrin/hyaluronic acid hydrogel for the delivery of mesenchymal stem cells and potential for articular cartilage repair[J]. J. Biol. Eng.，2014，8：10-21.

[6] 黃小忠，管國(guó)強(qiáng). 透明質(zhì)酸生理功能及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 畜牧與飼料科學(xué)，2015，36（1）：21-25.

[7] Platt V M，Szoka F C Jr. Anticancer therapeutics：Targeting macromolecules and nanocarriers to hyaluronan or CD44，a hyaluronan receptor[J]. Mol. Pharm.，2008，5（4）：474-486.

[8] Yadav A K，Mishra P，Agrawal G P. An insight on hyaluronic acid in drug targeting and drug delivery[J]. J. Drug Target，2008，16（2）：91-107.

[9] Tian H，Lin L，Chen J，et a1. RGD targeting hyaluronic acid coating system for PEI-PBLG polycation gene carriers[J]. J. Controlled Release，2011，155：47-53.

[10] Park S，Bhang S H，La W G，et a1. Dual roles of hyaluronic acids in muhilayer films capturing nanocarriers for drug-eluting coatings[J]. Biomaterials，2012，33：5468-5477.

[11] Picaud L，Thibault B，Mery E，et al. Evaluation of the effects of hyaluronic acid-carboxymethyl cellulose barrier on ovarian tumor progression[J]. J. Ovarian Res.，2014，7：40-52.

[12] Luo Y，Ziebell M R，Prestwich G D．A hyaluronic acid-taxol antitumor bioconjugate targeted to cancer cells[J]. Biomacromolecules，2000，1（2）：208-218.

[13] 蔣麗霞，王文斌. 透明質(zhì)酸及其衍生物在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[J]. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2010，14（15）：56-61.

[14] 徐新，施丹萍，葉玟希，等. 交聯(lián)透明質(zhì)酸衍生物的制備進(jìn)展[J]. 廣東化工，2012，39（5）：99-100.

[15] 韓飛，肖雄，謝山青，等. 新型藥用輔料——透明質(zhì)酸的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（17）：232-236.

[16] 陳建英，汪敏，劉杰，等. 注射用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的制備及其體外抗酶降解性的研究[J]. 中國(guó)生化藥物雜志，2008，29（4）：262-265.

[17] Vasi A M，Popa M I，Butnaru M，et al. Chemical functionalization of hyaluronic acid for drug delivery applications[J]. Mater. Sci. Eng. C，2014，38：177-185.

[18] 袁玉姣，蔣革，董爽. 透明質(zhì)酸衍生物在生物藥品傳遞方面的研究進(jìn)展[J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30（3）：232-238.

[19] Zhang H，Huang S，Yang X，et al. Current research on hyaluronic acid-drug bioconjugates[J]. Eur. J. Med. Chem.，2014，86：310-317.

[20] 鄧碧，葉琳，王馳，等. 脂質(zhì)體阿霉素對(duì)人鼻咽癌 HNE-1 細(xì)胞株增殖與凋亡作用的研究[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34（11）：1479-1481.

[21] 周平紅，秦新裕. 脂質(zhì)體阿霉素及其靶向治療研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2002，9（4）：331-333.

[22] Saravanakumar G， Choi K Y，Yoon H Y. Hydrotropic hyaluronic acid conjugates：Synthesis，characterization，and implications as a carrier of paclitaxel[J]. Int. J. Pharm.，2010，394：154-161.

[23] Cho H J，Yoon I S，Yoon H Y. Polythylene glycol-conjugated hyaluronic acid-ceramide self-assembled nanoparticles for targeted delivery of doxorubicin[J]. Biomaterials，2012，33：1190-1200.

[24] Goodarzi N，Ghahremani M H，Amini M，et al. CD44-targeted docetaxel conjugate for cancer cells and cancer stem-like cells：A novel hyaluronic acid-based drug delivery system[J]. Chem. Biol. Drug Des.，2014，83：741-752.

[25] 邱麗筠，黃麗麗，俞淑文. 透明質(zhì)酸在腫瘤治療藥物新型給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2014，9（16）：238-241.