陳偉，朱榮，葛春蕾，陸源，李利云，李菲，鄔敏辰

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人IL-29的定點突變及抗腫瘤活性初步分析

陳偉1，朱榮2，葛春蕾2，陸源3，李利云2，李菲1，鄔敏辰1

1 江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無錫 214122 2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122 3 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫 214122

陳偉, 朱榮, 葛春蕾, 等. 人IL-29的定點突變及抗腫瘤活性初步分析. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(5): 702–710.Chen W, Zhu R, Ge CL, et al.Site-directed mutagenesis of human IL-29 and antineoplastic activity of the recombinant human IL-29 variant. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 702–710.

為探討人白細(xì)胞介素-29 (hIL-29) 變異體的抗腫瘤活性，根據(jù)hIL-29成熟肽的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)，采用大引物PCR方法對其肽鏈第33位賴氨酸、35位精氨酸的編碼基因進(jìn)行定點突變，獲得的hIL-29變異體基因構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母 () GS115進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，經(jīng)純化得到重組人白細(xì)胞介素-29變異體蛋白 (rhIL-29mut33,35)。經(jīng)CCK-8法檢測抗腫瘤細(xì)胞增殖的數(shù)據(jù)顯示，rhIL-29mut33,35對肝癌細(xì)胞BEL7402、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8和胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖均具有抑制作用，高劑量組對這3種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率分別為 (30.99 ± 1.58)%、(22.47 ± 1.37)% 和 (32.05 ± 2.02)%，而且抗增殖作用比野生型rhIL-29的更強(qiáng) (< 0.01)，表明變異體rhIL-29mut33,35具有潛在的醫(yī)藥開發(fā)價值。

白細(xì)胞介素-29，定點突變，變異體，抗腫瘤活性

人IL-29是2003年初發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞因子[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-29和IL-28的靶細(xì)胞膜受體相同，是由IL-28R1和IL-10R2組成的異二聚體受體復(fù)合物，其中IL-28R1為結(jié)合亞基，對IL-29的細(xì)胞應(yīng)答具有特異性，IL-10R2為輔助亞基，對IL-29的細(xì)胞應(yīng)答無特異性[3]。而IL-29的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與Ⅰ型干擾素 (Interferon，IFN) 相同，通過激活Jak-STAT (Janus kinase-signal transducer of transcription) 信號通路而產(chǎn)生效應(yīng)[4-7]，因此IL-29表現(xiàn)出與Ⅰ型IFN相似的生物學(xué)性質(zhì)，如抗病毒、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、體內(nèi)抗腫瘤等生物學(xué)活性[8-12]。由此，IL-29、IL-28A和IL-28B又被稱為IFN-λ家族，它們分別稱為IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3[13-14]。

Gad等[3]研究發(fā)現(xiàn)，對IFN-λ3肽鏈中的 34 Arg、36 Lys和44 Leu等位點的氨基酸進(jìn)行定點突變，可明顯改變其抗病毒活性。本實驗室鄭海軍等[15]應(yīng)用生物信息學(xué)分析工具對人IL-29與IL-28B的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析比對，發(fā)現(xiàn)兩者的受體結(jié)合區(qū)域的A、F螺旋中僅4個氨基酸殘基不同，即IL-29/IL-28B肽鏈中的33 Lys/34 Arg、35 Arg/36 Lys、43 Lys/44 Leu和143 Ala/144 Pro，對這些氨基酸殘基進(jìn)行誘變可能影響IL-29與其受體結(jié)合的親和力，進(jìn)而改變IL-29的生物學(xué)活性。

基于上述研究發(fā)現(xiàn)和本實驗室前期研究基礎(chǔ)[16-17]，本文采用定點突變方法將IL-29成熟肽受體結(jié)合區(qū)域的33 Lys、35 Arg分別突變?yōu)?3 Arg、35 Lys，從而改變其與受體結(jié)合的親和力，以期獲得抗腫瘤活性更高的IL-29變異體。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒和腫瘤細(xì)胞株

大腸桿菌JM109、畢赤酵母GS115由本實驗室保存；質(zhì)粒pUCm-T購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；質(zhì)粒pPIC9KM購自Invitrogen公司；含hIL-29成熟肽基因的重組質(zhì)粒pPIC9KM由本實驗室構(gòu)建[17]；人肝癌細(xì)胞BEL7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8及人胃癌細(xì)胞SGC7901由江南大學(xué)藥學(xué)院金堅教授惠贈。

1.2 工具酶、培養(yǎng)基和生化試劑

plus DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA ladder marker、低分子量蛋白質(zhì)marker、EZ-10柱式DNA回收試劑盒和硝酸纖維素膜 (NC膜) 均為BBI公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母提取物為英國OXOID公司產(chǎn)品；YPD、MD、BMGY、BMMY、DAB、SDS、G418和RPMI-1640培養(yǎng)基等均為生工生物工程 (上海) 股份有限公司產(chǎn)品，培養(yǎng)基的配制按Invitrogen公司操作手冊；羊抗人IL-29多克隆抗體為美國R&D公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記兔抗羊IgG為上海明睿公司產(chǎn)品；新生小牛血清為浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液(100×)、Cell Counting Kit-8試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所；重組人干擾素α2b注射液為北京凱因科技股份有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 定點突變

根據(jù)NCBI公布的hIL-29的編碼基因序列 (GenBank登錄號：AY336716.1)，結(jié)合生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)，設(shè)計1對PCR引物及1條突變引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為編碼hIL-29成熟肽的cDNA，其堿基序列中第98位堿基T定點突變?yōu)镃，第104位堿基C定點突變?yōu)門，引物序列見表1。

表1 引物及其序列

The underlined sequences are the mutated sites.

hIL-29成熟肽基因的定點突變采用大引物PCR方法，以pPIC9KM-質(zhì)粒為模板、hIL-29-F和hIL-29-M為引物，進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃15 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。再進(jìn)行第二輪大引物PCR，以pPIC9KM-質(zhì)粒為模板、第一輪PCR產(chǎn)物和hIL-29-R為引物，反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，2個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 1 min，28個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用EZ-10 Spin Column DNA Extraction Kit回收目的基因，按說明書操作。回收的目的基因與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。

1.4 重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

pPIC9KM質(zhì)粒和測序正確的重組質(zhì)粒pUCm-T-mut33,35同時用Ⅰ和Ⅰ雙酶切，回收酶切后的目的基因和pPIC9KM質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶于10 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒用PCR進(jìn)行篩選，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-mut33,35，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。

經(jīng)測序鑒定的pPIC9KM-mut33,35用Ⅰ線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，轉(zhuǎn)化液涂布MD平板，挑選在MD平板上生長良好的菌落點種至含不同濃度G418的YPD平板，篩選出高拷貝整合的重組畢赤酵母，命名為mut33,35/GS115，電轉(zhuǎn)化及篩選按Invitrogen公司操作手冊。提取工程菌株mut33,35/GS115的基因組DNA，以通用引物5￠-AOX和3￠-AOX進(jìn)行PCR，鑒定目的基因是否整合入GS115基因組內(nèi)，重組工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)按Invitrogen公司操作手冊進(jìn)行。

1.5 rhIL-29mut33,35的分離純化及鑒定

誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，收集上清液用超濾管 (截留相對分子量為10 kDa，Millipore公司) 超濾濃縮后，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 (10 mmol/L，pH 6.0) 透析，然后加至預(yù)先用上述緩沖液平衡的SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換柱 (16 mm×200 mm)，以同樣緩沖液洗柱；以含NaCl的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 (NaCl 濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L，pH 6.0) 進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，收集各洗脫峰經(jīng)SDS-PAGE分析，將含有rhIL-29mut33,35的洗脫液超濾濃縮后冷凍干燥。

rhIL-29mut33,35的活性用Western blotting鑒定，取少量純化的重組蛋白凍干粉，以適量無菌超純水溶解，經(jīng)SDS-PAGE后將蛋白電轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)移的NC膜用TBST緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，15 mmol/L NaCl，0.05% 吐溫–20，pH 7.2) 漂洗5次，用含10%健康兔血清的TBST緩沖液4 ℃封閉過夜，次日用TBST漂洗5次，加入羊抗人IL-29抗體 (1∶1 000)37 ℃孵育2 h，TBST漂洗5次，加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG (1∶2 500) 37℃孵育1 h，TBST漂洗5次，用DAB試劑顯色。

1.6 rhIL-29mut33,35的抗腫瘤活性分析

將野生型rhIL-29、rhIL-29mut33,35、IFN-α2b (陽性對照) 分別設(shè)置50、500和1 000 ng/mL 3個劑量組，同時設(shè)置空白和陰性對照組(腫瘤細(xì)胞自然生長組)，每組設(shè)5個平行孔。

液氮凍存的BEL7402、HCT8和SGC7901細(xì)胞復(fù)蘇后，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液 (含10%小牛血清) 培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化和RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌后，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108個/mL，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔 (空白孔不接種)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸去上清液；取上述樣品用RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋，分別按劑量組每孔加入100 μL，空白和陰性對照組加入等體積的完全培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀測定450，計算各組樣品對3株腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，結(jié)果用SPSS軟件22.0進(jìn)行單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

增值抑制率 (Inhibition ratio，IR)＝(1－樣品組450值/陰性對照組450值) ×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 hIL-29成熟肽基因的定點突變

用大引物PCR方法對hIL-29基因進(jìn)行定點突變，第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收約130 bp的產(chǎn)物作為第二輪PCR的大引物，進(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約560 bp處有一條PCR產(chǎn)物條帶 (圖1，泳道1)，其大小與預(yù)期相符?；厥债a(chǎn)物與pUCm-T連接的重組質(zhì)粒pUCm-T-mut33,35，經(jīng)測序結(jié)果顯示，基因大小為563 bp，編碼181個氨基酸，將測定的mut33,35序列與hIL-29的編碼基因序列 (GenBank登錄號：AY336716.1) 比對顯示：第98位堿基T突變?yōu)镃，三聯(lián)體密碼由CTT突變?yōu)镃CT，編碼產(chǎn)物由Lys突變?yōu)锳rg；第104位堿基C突變?yōu)門，三聯(lián)體密碼由CCT突變?yōu)镃TT，編碼產(chǎn)物由Arg突變?yōu)長ys。將mut33,35與pPIC9KM連接構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-mut33,35經(jīng)測序鑒定，mut33,35的序列與在pUCm-T-mut33,35中的一致，且讀碼框完全正確。

圖1 hIL-29mut33,35的PCR擴(kuò)增

2.2 重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

按1.4的方法，線性化的pPIC9KM-mut33,35質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)G418篩選獲得高拷貝的重組工程菌株mut33,35/GS115。提取的工程菌株基因組DNA以通用引物5￠-AOX和3￠-AOX進(jìn)行PCR鑒定的結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為約2 200 bp和1 100 bp的DNA條帶，約2 100 bp的產(chǎn)物為酵母GS115的AOX1基因，約1 100 bp的產(chǎn)物包括目的基因 (563 bp) 和pPIC9KM質(zhì)粒上的5￠-AOX和3￠-AOX引物序列之間的片段(500 bp)，表明mut33,35基因已成功整合入酵母GS115基因組中(圖2)。

工程菌株mut33,35/GS115用1.5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h的發(fā)酵上清液，經(jīng)超濾和SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化的產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE分析的圖譜顯示，在約23 kDa處有一明顯目的蛋白條帶 (圖3，泳道3)，而pPIC9KM/GS115的發(fā)酵液在該處無相同條帶 (圖3，泳道2)。經(jīng)測定rhIL-29mut33,35的表觀分子量高于理論計算的相對分子量 (約20 kDa)，可能是rhIL-29mut33,35在酵母GS115表達(dá)過程中發(fā)生了糖基化修飾[18]所致。

圖2 重組畢赤酵母hIL-29mut33,35/GS115的PCR鑒定

圖3 工程菌株hIL-29mut33,35/GS115發(fā)酵液的SDS-PAGE分析

2.3 rhIL-29mut33,35的純化和鑒定

發(fā)酵上清的超濾濃縮液用SP-Sepharose Fast Flow層析純化，收集的NaCl梯度洗脫液經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，目的蛋白主要在0.4 mol/L和0.6 mol/L NaCl梯度被洗脫，而流穿峰和0.2 mol/LNaCl緩沖液洗脫的主要是色素和雜蛋白。從PAGE圖譜分析，以0.4 mol/L NaCl緩沖液洗脫的目的蛋白純度較高，而0.6 mol/L NaCl緩沖液的洗脫峰還含有少量雜蛋白 (圖4)。如需獲得純度更高的目的蛋白，可將0.4 mol/L和0.6 mol/L NaCl的洗脫峰合并后，進(jìn)一步用分子篩層析純化。

純化的rhIL-29mut33,35經(jīng)Western blotting分析結(jié)果顯示，rhIL-29mut33,35與羊抗人IL-29抗體反應(yīng)后，在NC膜上呈現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，其大小約為23 kDa (圖5)，與SDS-PAGE圖譜的條帶大小相同，但反應(yīng)條帶彌散，這可能是電泳轉(zhuǎn)移過程中電極緩沖液溫度升高和Western blotting的放大效應(yīng)所致。

2.4 rhIL-29mut33,35的抗腫瘤活性分析

用CCK-8試劑檢測rhIL-29mut33,35對腫瘤細(xì)胞BEL7402、HCT8和SGC7901的增殖抑制結(jié)果表明，各劑量組均顯示增殖抑制效應(yīng)，且細(xì)胞增殖抑制率隨著rhIL-29mut33,35劑量的增加而增大，具有較明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系 (圖6?8)。

圖4 rhIL-29mut33,35的SP Sepharose Fast Flow層析純化圖譜與洗脫峰的SDS-PAGE分析

單因素方差分析結(jié)果顯示，rhIL-29mut33,35、野生型rhIL-29及商品化的IFN-α2b對3株腫瘤細(xì)胞的增殖均具有抑制效應(yīng)，但對不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率各有差異。rhIL-29mut33,35的低、中、高劑量組對肝癌細(xì)胞BEL7402增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用 (圖6)，尤其高劑量組的抑制率達(dá)(30.99±1.58)% (<0.01)。對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8，僅高、中劑量組rhIL-29mut33,35的抑制作用比野生型rhIL-29的更強(qiáng) (< 0.05)，低劑量組的抑制效應(yīng)差異不大 (圖7)。rhIL-29mut33,35的高劑量組對胃癌細(xì)胞SGC7901的抑制率達(dá)32.05 ± 2.02%，顯著高于野生型rhIL-29的作用(< 0.01)，提示變異體rhIL-29mut33,35可能對胃癌細(xì)胞SGC7901具有較好的增殖抑制效應(yīng) (圖8)。

圖5 rhIL-29mut33,35的Western blotting鑒定

圖6 rhIL-29mut33,35對肝癌細(xì)胞BEL7402的增殖抑制效應(yīng)

圖7 rhIL-29mut33,35對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8的增殖抑制效應(yīng)

圖8 rhIL-29mut33,35對胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖抑制效應(yīng)

3 討論

自IL-29被發(fā)現(xiàn)以來，由于其具有與Ⅰ型干擾素相似的生物學(xué)活性而受到廣泛的關(guān)注，國際上對IL-29的生物學(xué)功能與醫(yī)藥應(yīng)用的相關(guān)研究日益深入。雖然IL-29與Ⅰ型IFN通過激活相同的 Jak-STAT信號通路而產(chǎn)生效應(yīng)，但人體不同組織器官中IL-29受體 (IL-28R1) 的表達(dá)具有明顯差異[19-20]。本研究獲得的變異體rhIL-29mut33,35對3株不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)不同，也可能與這些細(xì)胞表面IL-28R1的表達(dá)差異有關(guān)。IL-28R1在人體不同組織細(xì)胞表達(dá)的差異，使IL-29作用的靶細(xì)胞比Ⅰ型IFN的更局限。因此，IL-29作為潛在的新型干擾素類藥物，其臨床副作用可能比Ⅰ型IFN的更小[21]。

在抗病毒活性方面，國際上對IL-29的開發(fā)已進(jìn)入臨床應(yīng)用研究，Ⅰ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)，用聚乙二醇 (Polyethylene glycol, PEG) 對IL-29 (IFN-λ1) 進(jìn)行修飾后，PEG-IFN-λ1的半衰期和穩(wěn)定性均得到提高，同時最大限度地保留了IFN-λ1的生物學(xué)活性[22-23]。目前，PEG-IFN-λ1已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗，其臨床適應(yīng)癥為丙型病毒性肝炎，給藥劑量為80–240 μg，每周1次，以聚乙二醇化IFN-α2a (PEGASYS) 為對照。經(jīng)4–12周臨床應(yīng)用顯示PEG-IFN-λ1的療效良好，與PEGASYS的效果基本相同，但不良反應(yīng)更少，藥物作用更溫和，其他IFN常見的不良反應(yīng)如肌痛、疲勞、惡心和頭痛等的發(fā)生率有所下降[24-25]。

本文采用定點突變方法對野生型hIL-29進(jìn)行分子改造，獲得的變異體rhIL-29mut33,35經(jīng)初步分析，顯示出較好的體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，而且抗增殖作用要高于野生型rhIL-29的 (<0.01)，表明變異體rhIL-29mut33,35具有潛在的醫(yī)藥開發(fā)價值，為后續(xù)研制開發(fā)新的干擾素類抗腫瘤藥物奠定了良好的基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Site-directed mutagenesis of human IL-29 and antineoplastic activity of the recombinant human IL-29 variant

Wei Chen1, Rong Zhu2, Chunlei Ge2, Yuan Lu3, Liyun Li2, Fei Li1, and Minchen Wu1

1,,214122,,2,,214122,,3,,214122,,

To explore the anti-tumor proliferation activity of human interleukin-29 (hIL-29) variant and based on bioinformatics analyzed data of hIL-29, a mutant gene-29was amplified by site-directed mutagenesis and megaprimer PCR. The-29was inserted into an eukaryotic expression plasmid pPIC9K and successfully expressed inGS115. A recombinant variant protein (rhIL-29mut33,35) was purified from the ferment supernatant of the engineering GS115. To observe the antineoplastic activity of the variant rhIL-29mut33,35, a CCK-8 reagent was used to detect the anti-proliferation effect. Results show that it has strong anti-proliferation effect when acted on liver cancer cell BEL7402, colon cancer cell HCT8 and gastric cancer cell SGC7901. The inhibition ratios of the three tumor cells were (30.99 ± 1.58)%, (22.47 ± 1.37)% and (32.05 ± 2.02)%, respectively. In high dose group, the anti-proliferation effect of the rhIL-29mut33,35was stronger than that of wild type rhIL-29 (< 0.01). This indicates the variant rhIL-29mut33,35has potential development value for medicine.

interleukin-29, site-directed mutagenesis, variant, antineoplastic activity

August 29, 2014; Accepted:November 15, 2014

Wei Chen. Tel: +86-510-85328296; E-mail: chenwei@jiangnan.edu.cn

Supported by:National Undergraduate Innovative Training Programs (No. 201210295024).

國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目 (No. 201210295024 ) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-02-03

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140429.html