賈瀟瀟，李晶，秦天，鄧愛華，劉文軍

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表面增強拉曼光譜技術(shù)在微生物鑒定中的應(yīng)用進展

賈瀟瀟1,2，李晶1，秦天3，鄧愛華4，劉文軍1

1 中國科學(xué)院微生物研究所病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206 4 中國科學(xué)院微生物研究所微生物生理與代謝工程重點實驗室，北京 100101

賈瀟瀟, 李晶, 秦天, 等. 表面增強拉曼光譜技術(shù)在微生物鑒定中的應(yīng)用進展. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(5): 611–620.Jia XX, Li J, Qin T, et al. Current views on surface enhanced Raman spectroscopy in microbiology. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 611–620.

拉曼光譜自20世紀(jì)20年代被發(fā)現(xiàn)以來，經(jīng)過近90年的發(fā)展，產(chǎn)生了許多分支。其中表面增強拉曼光譜是利用被測物質(zhì)與粗糙金屬表面的相互作用來提高拉曼光譜的信噪比，從而得到敏感度和精確度更高的圖譜，可以將樣品在不經(jīng)過預(yù)處理的情況下對其進行快速檢測。本文綜述了表面增強拉曼光譜技術(shù)的原理、分類及鑒定特點，總結(jié)了該技術(shù)在食品、化學(xué)、醫(yī)藥、工業(yè)、病原等微生物學(xué)科的臨床應(yīng)用，進一步闡述了研究該技術(shù)的必要性和應(yīng)用前景，旨在為從事該領(lǐng)域的科研人員提供參考依據(jù)。

表面增強拉曼光譜，微生物，應(yīng)用

拉曼散射是光散射現(xiàn)象的一種，單色光束的光子與分子相互作用時可發(fā)生彈性碰撞和非彈性碰撞，拉曼散射是由光子的非彈性碰撞產(chǎn)生的[1]。發(fā)生彈性碰撞的散射過程又稱為瑞利散射，碰撞過程中分子和光子之間沒有發(fā)生能量的交換，碰撞后分子只改變了運動方向而不改變運動頻率。與彈性碰撞不同，這種非彈性碰撞過程中光子與分子之間發(fā)生能量交換，即光子將一部分能量傳遞給了分子，或分子的振動和轉(zhuǎn)動能量傳遞給光子，因此光子在改變運動方向的同時也改變了運動的頻率。自1928年被印度科學(xué)家拉曼(Raman C.V.) 在實驗中首次發(fā)現(xiàn)[2]，隨后逐漸應(yīng)用到物質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定中(表1)。

拉曼光譜分為表面增強拉曼效應(yīng)[15]、共振拉曼光譜、表面增強共振拉曼光譜、自發(fā)性拉曼光譜、光學(xué)鉗拉曼光譜、空間補償拉曼光譜[16]、同調(diào)anti-Stokes拉曼光譜、拉曼光學(xué)活性[17]、受激拉曼增益光譜、逆拉曼光譜、針尖增強拉曼光譜等。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一種基于納米結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS) 被發(fā)明，這種技術(shù)通過使用金屬顆粒與被測分子間的相互作用來提高圖譜的信噪比，從而使得實驗結(jié)果更加顯著。SERS技術(shù)作為一種新興的光學(xué)分析手段，已經(jīng)應(yīng)用于環(huán)境分析、材料分析和化學(xué)品檢測等領(lǐng)域[18]，在微生物研究領(lǐng)域初步探索了在食品微生物鑒定中的應(yīng)用，對病原微生物的相關(guān)研究甚少。

表1 拉曼光譜發(fā)展關(guān)鍵點

1 表面增強拉曼光譜

1.1 表面增強拉曼光譜的定義

當(dāng)一些分子被吸附到某些粗糙的金屬(金、銀等) 表面，借助于兩者之間的相互作用，可以很大程度地增強拉曼信號，從而得到高信噪比的圖譜，即產(chǎn)生了表面增強拉曼散射效應(yīng)，是一種特殊的表面光學(xué)現(xiàn)象。

1.2 表面增強拉曼光譜的原理及特點

SERS的基本原理是利用不同的金屬納米顆?；蚝怂岱肿与s交等技術(shù)[19]增強拉曼信號，從而得到更好的檢測圖譜[20]。由于拉曼光譜強度太弱，且沒有找到較合適的激發(fā)光源，因此沒有得到較大范圍的應(yīng)用。直至20世紀(jì)70年代激光作為高強度的激發(fā)光源被應(yīng)用到拉曼光譜的檢測中，拉曼光譜技術(shù)才逐漸被使用于各專業(yè)的科學(xué)研究中。

1.3 表面增強拉曼光譜技術(shù)

表面增強拉曼光譜技術(shù)是基于表面增強拉曼光譜的原理結(jié)合顯微共焦激光拉曼光譜儀等先進的儀器設(shè)備將待測樣品進行快速檢測并進行圖像化處理的手段。該技術(shù)的應(yīng)用可以為科研人員提供更多參考依據(jù)，在實驗方案的選擇和設(shè)計上具有啟發(fā)意義。

2 SERS技術(shù)在食品、化學(xué)、醫(yī)藥、工業(yè)等學(xué)科的應(yīng)用

由于具有檢測快速方便、所需樣品少且不損壞樣品以及靈敏度高等特點，近些年來SERS技術(shù)在食品、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。

2.1 在食品學(xué)科的應(yīng)用

在我們?nèi)粘z入的食品中，可能存在著多種農(nóng)藥、殺蟲劑殘留物，利用SERS技術(shù)可以實現(xiàn)對這些殘留物的快速檢測。Müller等[21]使用便攜式拉曼光譜儀對香蕉和柑橘類中可能存在的噻苯咪唑(驅(qū)蟲劑) 進行了SERS的檢測，結(jié)果顯示市場中噻苯咪唑(驅(qū)蟲劑) 在香蕉中的使用量在安全范圍以內(nèi)，而在柑橘類中的含量超標(biāo)嚴(yán)重。此外，Wijaya等[22]使用未經(jīng)處理的蘋果表皮和蘋果汁作為研究對象，針對一種新型堿類殺蟲劑啶蟲脒在食品中的殘留量進行了SERS的快速檢測。樣品都未經(jīng)過預(yù)處理，實驗發(fā)現(xiàn)在蘋果汁中至少有3 μg/mL的啶蟲脒，而在蘋果皮中發(fā)現(xiàn)啶蟲脒的濃度為2.5 μg/kg，遠低于最高限定濃度1 000 μg/kg。

不法分子在食品的生產(chǎn)加工過程中可能摻入多種違禁成分，快速地鑒別食品中是否含有禁止使用的添加成分對食品安全的保障具有重要意義，SERS技術(shù)的使用滿足了這一檢測的需求。例如Roy等[23]將金納米顆粒制成20–30 nm作為增強劑，對牛奶中的三聚氰胺含量進行了檢測。除使用金納米顆粒外，研究發(fā)現(xiàn)在石墨與銀納米顆粒共同作用下可以進一步優(yōu)化SERS的效果[24]。通過這一方法研究人員對幾種在食品中被禁止使用的色素進行了SERS的檢測，證明這種技術(shù)可以將多種混合的色素成分通過各自的特征峰進行快速區(qū)別，這為食品的安全檢測工作提供了有力的技術(shù)支撐。

2.2 在化學(xué)學(xué)科的應(yīng)用

人們較早地將SERS應(yīng)用于化學(xué)領(lǐng)域，隨著納米制備和表征技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)若干金屬離子可顯著提高拉曼光譜技術(shù)的實驗效果。Dasary等[25]利用SERS技術(shù)對存在于水和鹽中的碘離子進行了高選擇性和高敏感性的測定，結(jié)果顯示金納米顆粒的表面吸引了眾多帶電的Rh6G分子并且以聚合體的形式顯著誘導(dǎo)了熱點數(shù)量的增加，另外利用過氧化氫(H2O2) 將I–氧化為I2這一方法被成功用來進行針對在高濃度下會產(chǎn)生嚴(yán)重干擾的溴離子(Br–) 的篩選。除金納米顆粒以外，銀溶膠也可以作為表面增強劑應(yīng)用于實驗中，Temiz等[26]利用4種在大分子邊緣被1,8-萘二甲酰亞胺進行了化學(xué)修飾的新合成的聚(丙烯胺) 樹枝狀分子作為配體進行對重金屬離子的SERS檢測。在這些大分子和銀溶膠的共同作用下可以檢測到低濃度重金屬離子的拉曼光譜，得到的數(shù)據(jù)與主成分分析結(jié)果相符。

2.3 在醫(yī)藥、工業(yè)中的應(yīng)用

SERS技術(shù)在醫(yī)藥、工業(yè)領(lǐng)域中也發(fā)揮重要的作用，研究人員可通過對藥品快速檢測，來鑒定其中是否含有違禁成分，同時也可以對藥品進行篩選來保證市場中藥物的安全。Zhang等[27]利用銀溶膠為基底的SERS技術(shù)對中國傳統(tǒng)專利藥品中的違禁成分進行了分析，發(fā)現(xiàn)了鹽酸羅格列酮、鹽酸苯乙雙胍、鹽酸二甲雙胍、鹽酸吡格列酮和鹽酸西布曲明等非法藥物成分，這些藥物成分可以使患者的病癥短時間內(nèi)得到好轉(zhuǎn)，但是會帶來不可預(yù)測的副作用。此外SERS技術(shù)也被用于疾病如尿道疾病、癌癥診斷和體外癌細胞的檢測，MUC4作為早期胰腺癌的一個血清標(biāo)記[28]，可以利用表面拉曼增強光譜進行定量檢測，而對多種生物標(biāo)記物的檢測使得人們對肺癌的診斷更加準(zhǔn)確[29]。另外，通過建立DNA-金納米顆粒探測技術(shù)，人們在3種不同的乳腺癌細胞系中都發(fā)現(xiàn)了CD44+/CD24-細胞，表明SERS技術(shù)可以通過檢測細胞表面標(biāo)記蛋白來鑒定乳腺癌干細胞中CD44+/CD24-的含量[30]。在工業(yè)學(xué)科領(lǐng)域，芽胞桿菌由于它強大的生產(chǎn)胞外酶的能力而備受關(guān)注，因而對其進行快速鑒別就顯得尤為重要。Deng等[31]利用SERS將從中國西藏分離得到的14種芽胞桿菌進行了檢測，多元分析清晰地將這些菌株分為了3類(圖1)，這與它們的16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果完全一致。

圖1 工業(yè)微生物中14株芽胞桿菌SERS分離鑒定[31]

3 SERS技術(shù)在病原微生物學(xué)科中的研究

3.1 在病原細菌學(xué)中的研究

3.1.1 利用SERS對混合菌種進行鑒定

SERS技術(shù)在病原微生物中的一個重要應(yīng)用是在不依賴培養(yǎng)基的情況下對從環(huán)境中或患者體內(nèi)直接分離的病原菌進行快速檢測和鑒定，從而提高效率、節(jié)省成本。該方法不僅可以進行單一菌種的鑒定，也可以對混合菌種進行準(zhǔn)確地篩選。Xu等[32]發(fā)現(xiàn)由于細菌細胞膜表面有大量的生化成分，它們可以作為菌種快速識別和鑒定的標(biāo)志。他們利用SERS對從美國華盛頓臨床病人和環(huán)境中分離獲得的4種基因型的7株副溶血弧菌進行了鑒定，結(jié)果顯示7株細菌都有可區(qū)別于其他菌株的特征峰。他們還將編號為551和3652的兩株菌按照2∶1、1∶1、1∶2的體積比分別混合進行SERS的檢測，發(fā)現(xiàn)兩種細菌從各自的特征峰圖中被明顯區(qū)分出來，其中551號副溶血弧菌的特征峰出現(xiàn)在1 002 cm–1、 1 177 cm–1、1 532 cm–1處，而3652號副溶血弧菌的特征峰則出現(xiàn)在525 cm–1、738 cm–1、1 319 cm–1、1 639 cm–1處，表明該方法在單個菌種樣品和多菌種混合物樣品中都能得到良好的鑒定結(jié)果。呂璞等[33]將大腸桿菌和志賀氏菌與納米銀顆粒混合后用SERS進行了檢測，發(fā)現(xiàn)這兩種細菌產(chǎn)生了完全不同的特征圖譜，大腸桿菌的拉曼振動峰出現(xiàn)在658 cm–1、728 cm–1、960 cm–1等處，而志賀氏菌的振動峰出現(xiàn)在670 cm–1、820 cm–1、1 330 cm–1等處。實驗分別進行了3次重復(fù)，檢測結(jié)果均具有良好的重現(xiàn)性。研究人員發(fā)現(xiàn)在使用化學(xué)計量法的基礎(chǔ)上，SERS可以用于區(qū)分細菌的種類和血清型，他們用銀納米顆粒作為基底對綠豆芽中的古沙門氏菌、斯坦利沙門氏菌、表皮葡萄球菌等6種食源性致病菌進行了SERS的鑒定和區(qū)分[34]。

Meisel等[35]對19種主要的食源性致病菌進行了SERS的檢測，得到的數(shù)據(jù)被分等級鑒定，第一等級為將測定菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，再通過另外兩個重要的節(jié)點區(qū)分病原細菌的種屬，實驗結(jié)果表明每級的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度在90.6%–99.5%的范圍內(nèi)。

3.1.2 利用SERS對常見病原菌的快速檢測

金黃色葡萄球菌是最常見的病原菌之一，Lu等[36]利用微流體芯片與SERS技術(shù)結(jié)合對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進行了快速鑒定，黃玉坤等[37]也利用金納米顆粒與樣品混合對食品中的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌等進行了SERS的快速檢測，研究表明整個檢測過程耗時非常短，檢測過程只需要十幾秒的時間，并且與傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、菌落分離、血清學(xué)鑒別實驗等方法得到同樣準(zhǔn)確的結(jié)果，可以作為食品衛(wèi)生監(jiān)管中的快速診斷方法。

尿路感染是一種常見的病癥，目前對于感染病菌檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法[38]，但這種方法耗時較長。Klo?等[38]針對尿道感染的患者樣本進行了SERS與化學(xué)計量學(xué)結(jié)合的檢測，實驗結(jié)果表明SERS技術(shù)可在2 h內(nèi)不需要培養(yǎng)基的情況下對患者體內(nèi)的尿液樣本進行準(zhǔn)確檢測，并且可以確定感染的主要菌群，精確度可以達到92%以上。

大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌等常見的病原菌的快速鑒定和區(qū)分也都相繼應(yīng)用SERS技術(shù)來實現(xiàn)。將菌體與銀納米顆粒共同作用后的SERS可以達到單細胞檢測的水平。Fan等[39]利用銀納米顆粒對常見的食源性致病菌如大腸桿菌O157：H7、表皮葡萄球菌、單核細胞增多性李斯特菌和腸球菌等進行了SERS的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在500–1 800 cm–1區(qū)間不同菌種的峰圖差別最明顯。Wang等[40]利用反向微乳液法 (溴化十六烷基三甲銨為表面活性劑、原硅四乙酯為二氧化硅先導(dǎo)) 制成直徑100 nm內(nèi)的二氧化硅包裹的磁性探針，為了驗證它的敏感度，研究人員將金黃色葡萄球菌混于PBS緩沖液中，實驗發(fā)現(xiàn)探針能檢測到的最低濃度為102CFU/mL，證明這種基于SERS的探針具有高度的敏感性。Sundaram等[41]利用銀納米顆粒對鼠傷寒、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及李斯特菌進行了SERS的檢測，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性和陰性菌菌體細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)沒有明顯區(qū)別，而主要的區(qū)別在于核苷酸和氨基酸，各自的特征峰主要集中在1 200–1 700 cm–1和400–700 cm–1之間。

目前利用SERS針對病原菌的快速檢測主要集中在腸道病原菌，但是針對呼吸道病原菌的快速區(qū)別鑒定研究還較少，并且也缺少一個完善的可供參考的數(shù)據(jù)系統(tǒng)。

3.2 在病原微生物中病毒學(xué)及其他學(xué)科中的研究

在SERS技術(shù)的優(yōu)化方面，除與金屬離子共同作用之外，利用SERS技術(shù)也可以實現(xiàn)病毒的檢測。Cao等[19]采用核酸分子雜交技術(shù)同時檢測了A/B型肝炎病毒、艾滋病病毒、埃博拉病毒、天花病毒和炭疽桿菌抗原等6種病原微生物。結(jié)構(gòu)簡單的單個球形金納米顆?？杀挥糜诙康目乖瓩z測，而二聚化的金納米顆?？梢越档蜋z測濃度的最低限度。Lee等[42]利用雙功能病毒SERS探針在一端作為抗體，與金納米顆粒結(jié)合的方式共同用于SERS的檢測。

Zhao等[43]利用銀納米顆粒作為基底，對流感病毒的3種不同毒株A/HKx31、A/WSN/33和A/PR/8/34進行了SERS的鑒定。在病毒樣品體積小于5 μL的情況下拉曼光譜儀1 min內(nèi)完成了收集，并且根據(jù)峰圖之間的區(qū)別 (圖2灰色區(qū)域) 可以清楚地鑒別出不同種毒株，結(jié)果顯示SERS可以用來鑒別同一病原菌的不同種毒株。

除了常見的致病細菌及病毒外，一些支原體、衣原體等微生物也對農(nóng)業(yè)等發(fā)展產(chǎn)生了嚴(yán)重危害。目前美國家禽中的支原體檢測主要依靠技術(shù)工人，并且不能保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。Hennigan等[44]利用NA-SERS對家禽中的萊式無膽甾原體、雞敗血性支原體、滑液支原體、泰樂菌素等進行了快速檢測，結(jié)果表明此方法對檢測條件要求較低并且比標(biāo)準(zhǔn)PCR和Real-time PCR檢測效果更好。

圖2 流感病毒不同毒株的SERS鑒定[43]

SERS在判斷正常結(jié)腸組織與惡性腫瘤中也可以發(fā)揮重要作用，Lopes等[45]對11個人體結(jié)腸樣本進行了測定，獲得55張圖譜，觀察到了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸的峰圖，其中根據(jù)條帶強度差異所得到的差別較大的條帶可能是關(guān)鍵的區(qū)別點。隨后對條帶強度和強度比率進行的線性分析表明此方法的精確度達到了81%。目前針對結(jié)腸癌主要傾向于利用一些小分子進行靶向治療。對靶向分子及其代謝物的探測一般都需要攜帶熒光標(biāo)簽，而這些標(biāo)簽中可能帶有毒素，對患者造成傷害。目前有研究人員利用SERS技術(shù)對細胞內(nèi)藥物的空間分布進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物聚集在細胞膜表皮生長因子受體上并且誘導(dǎo)受體內(nèi)在化，這項研究在細胞內(nèi)的原子水平上闡釋了藥物分子的靶向作用機制[46]。

4 小結(jié)

4.1 研發(fā)微生物檢測與鑒定用試劑盒

SERS技術(shù)由于光譜的特有性質(zhì)，不同微生物的SERS存在著一定的差異，如同進行人的指紋鑒定一樣，利用不同微生物的“光譜指紋”差異即可對不同微生物進行區(qū)分。這一方法的第一個特點是不需要對樣本進行標(biāo)記，檢測過程快速，通常一個拉曼光譜在30 s內(nèi)即可完成；第二個特點是其檢測成本較低，納米基質(zhì)價格較低且可以反復(fù)使用，除拉曼光譜儀外基本無其他消耗品的需求，所以整套設(shè)備價格相對較低，有市場推廣性；第三個特點是拉曼光譜儀可以實現(xiàn)小型化、便攜化，可實現(xiàn)現(xiàn)場、野外的檢測。目前國內(nèi)外沒有將該技術(shù)應(yīng)用于臨床鑒定的使用，尤其是針對病原微生物的鑒定與檢測中，對其及時、準(zhǔn)確地預(yù)報預(yù)警在疾病預(yù)防控制中有著較為重要的作用。將SERS技術(shù)進行臨床產(chǎn)品的檢驗，進一步摸索靈敏度、重現(xiàn)性、特異性、成本分析等條件和指標(biāo)，將其進行微生物檢測與鑒定用試劑盒或試紙條的研發(fā)和推廣，以上所述為我們下一步的研究重點。

4.2 建立SERS技術(shù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫平臺

目前的研究現(xiàn)狀顯示，SERS技術(shù)僅對某些微生物進行了檢測和鑒定，沒有廣泛地將微生物進行SERS技術(shù)圖像收集和匯總，建立可搜索、可操作的數(shù)據(jù)庫和共享的網(wǎng)絡(luò)平臺。建立多種微生物的“拉曼光譜指紋”數(shù)據(jù)庫與網(wǎng)絡(luò)共享平臺將可跨越時間和地區(qū)的界限，實現(xiàn)多研究機構(gòu)資源共享。分析拉曼光譜圖，確定特征峰，通過對已知微生物進行拉曼光譜指紋的獲取，并與利用傳統(tǒng)方法鑒定的微生物信息進行匹配，從而建立特異的光譜指紋數(shù)據(jù)庫，是我們下一步工作的切入點。

綜上所述，SERS技術(shù)的應(yīng)用可實現(xiàn)對微生物高精度與快速的鑒定，并逐步完成相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)與成果轉(zhuǎn)化，同時可完成多種微生物“拉曼光譜指紋”庫的建立，完成相關(guān)技術(shù)儲備，發(fā)展成具有國際領(lǐng)先水平的快速鑒定網(wǎng)絡(luò)共享平臺，滿足微生物領(lǐng)域中對臨床樣品快速、現(xiàn)場的需求。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Current views on surface enhanced Raman spectroscopy in microbiology

Xiaoxiao Jia1,2, Jing Li1, Tian Qin3, Aihua Deng4, and Wenjun Liu1

1 Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China 4 Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Raman spectroscopy has generated many branches during the development for more than 90 years. Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) improves SNR by using the interaction between tested materials and the surface of rough metal, as to quickly get higher sensitivity and precision spectroscopy without sample pretreatment. This article describes the characteristic and classification of SERS, and updates the theory and clinical application of SERS. It also summarizes the present status and progress of SERS in various disciplines and illustrates the necessity and urgency of its research, which provides rationale for the application for SERS in microbiology.

surface enhanced Raman spectroscopy, microbiology, application

August 19, 2014; Accepted: October 15, 2014

Jing Li. Tel/Fax: +86-10-64807503; E-mail: lj418@163.com

Supported by:National Key Technologies Research and Development Program of China (No. 2013ZX10004-610), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31402216, 81101253), Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KSZD-EW-Z-005-001).

“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項 (No. 2013ZX10004-610)，國家自然科學(xué)基金(Nos. 31402216, 81101253)，中國科學(xué)院重點部署項目 (No. KSZD-EW-Z-005-001) 資助。