姚楠，白杰，張雪梅，張寧，吳衛(wèi)東，李文蓉

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牛殺菌/通透性增加蛋白對(duì)脂多糖介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

姚楠1,2,4*，白杰1,3*，張雪梅1，張寧1，吳衛(wèi)東2，李文蓉1

1 農(nóng)業(yè)部草食家畜遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，新疆烏魯木齊 830000 2 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊 830000 3 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002 4 新疆維吾爾自治區(qū)克拉瑪依市人民醫(yī)院，新疆克拉瑪依 834000

姚楠, 白杰, 張雪梅, 等. 牛殺菌/通透性增加蛋白對(duì)脂多糖介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(2): 195-205.Yao N, Bai J, Zhang XM, et al. Effects on the expression of lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokines mediated by bovine bactericidal/permeability-increasing protein. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 195-205.

殺菌/通透性增加蛋白 (Bactericidal/permeability-increasing protein, BPI) 能結(jié)合并特異地中和來(lái)自革蘭氏陰性菌外膜的脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS)。為了研究牛源BPI蛋白及其 N端結(jié)構(gòu)域在LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中的作用，本文將全長(zhǎng)1 449 bp編碼區(qū)序列 () 和其N(xiāo)端714 bp的編碼區(qū)序列 () 分別導(dǎo)入mHEK293細(xì)胞，分析了穩(wěn)定表達(dá)的BPI或BPI714對(duì)LPS介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響。首先將構(gòu)建的pLEX-BPI/pLEX-BPI714載體分別轉(zhuǎn)染mHEK293細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)牛源BPI或BPI714的mHEK293細(xì)胞；然后用LPS刺激上述細(xì)胞，分別收集刺激前、刺激后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h的細(xì)胞，并同時(shí)收集未表達(dá)BPI或BPI714的 mHEK293細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的樣品作為對(duì)照；采用定量RT-PCR檢測(cè)上述細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)水平，比較LPS刺激前后表達(dá)BPI/BPI714和對(duì)照細(xì)胞中上述基因轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律。研究表明，LPS刺激后，對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)水平在不同時(shí)間點(diǎn)均顯著提高 (<0.05)，并呈現(xiàn)規(guī)律性變化；而穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714的細(xì)胞在同樣刺激條件下，基因的轉(zhuǎn)錄水平均未發(fā)生顯著變化 (>0.05)。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在mHKE293細(xì)胞模型中BPI或BPI714均能顯著降低LPS介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)，抑制LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這不僅為進(jìn)一步研究BPI抑菌機(jī)制和利用其抑菌功能提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為分析抗菌蛋白的抗菌效果提供了一種可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

殺菌/通透性增加蛋白，脂多糖，免疫應(yīng)答，炎性細(xì)胞因子

在人和動(dòng)物生活的環(huán)境中存在著大量的革蘭氏陰性菌，脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS) 是革蘭氏陰性菌菌膜的組成部分。在革蘭氏陰性菌侵入動(dòng)物機(jī)體后，LPS被機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)TLR識(shí)別，當(dāng)機(jī)體檢測(cè)到LPS的入侵信號(hào)后，在轉(zhuǎn)錄因子家族 (Nuclear factor-κ-gene binding,) 的調(diào)控下，白介素8 (Interleukin- 8,)、白介素1β (Interleukin-1β,) 和腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor-α,) 等促炎癥因子的表達(dá)水平都急劇增加，產(chǎn)生清除病原菌的免疫反應(yīng)[1-2]。殺菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasing protein,) 是機(jī)體在免疫反應(yīng)中釋放的免疫分子，它與LPS有很高的親和能力，可以特異地中和LPS，對(duì)革蘭氏陰性菌有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性效應(yīng)[3-4]。

基因最初是在人中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[5]，嗜酸性粒細(xì)胞也有低水平的表達(dá)[6]。隨著研究的深入，在人胃腸道上皮細(xì)胞[7]、皮膚成纖維細(xì) 胞[8]、淚腺管上皮細(xì)胞[9]、生殖道上皮細(xì)胞[10]中都檢測(cè)到BPI的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。牛源BPI蛋白研究相對(duì)較少，目前主要集中在基因多態(tài)性對(duì)基因功能的影響及BPI體外表達(dá)后抑菌功能的研究，對(duì)牛BPI抑菌機(jī)制的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)將牛源的基因轉(zhuǎn)入到mHEK293 (該細(xì)胞系由白杰等[11]參考Sauter等[12]的方法，將牛源的基因轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞后，該細(xì)胞系具有了免疫應(yīng)答能力，是研究牛天然免疫反應(yīng)的細(xì)胞模型) 細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，期望了解LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，基因穩(wěn)定表達(dá)對(duì)炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。此外，研究顯示人源BPI與LPS結(jié)合的核心區(qū)域位于BPI蛋白N端。因此，本研究克隆獲得了牛源基因CDS全長(zhǎng)及N端的編碼序列，開(kāi)展了二者對(duì)LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)影響的研究。本研究有助于了解牛源的抗菌機(jī)理，為進(jìn)一步利用其抗菌活性，降低奶牛乳腺炎的發(fā)病率，提高牛奶食用的安全性提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種及細(xì)胞

DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根公司；pMD20-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；pLEX-MCS慢病毒表達(dá)載體及其包裝質(zhì)粒pMD2G、pSPAX購(gòu)自O(shè)penbiosystem公司；用于生產(chǎn)重組慢病毒的293T包裝細(xì)胞購(gòu)自ATCC公司。包含牛源基因的mHEK293細(xì)胞系由新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)中心提供。

1.1.2 酶及主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶HⅠⅠ購(gòu)自Fermentas公司；T4 DNA連接酶、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；Trizol試劑和Lipofectamine? 2000試劑購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；HA抗體購(gòu)自北京天根公司；熒光二抗購(gòu)自L(fǎng)I-COR公司；QuantiTect SYBR GreenⅠ試劑購(gòu)自QIAGEN公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 牛BPI/BPI714基因表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)基因的mRNA序列 (NM_173895.2)，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增?；騈端序列 (大小為714 bp) 的一對(duì)PCR引物，上、下游引物分別引入HⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)，下劃線(xiàn)部分為HA標(biāo)簽序列。同時(shí)設(shè)計(jì)另一對(duì)引物用以擴(kuò)增全長(zhǎng)CDS序列 (大小為1 449 bp)，引物也分別引入HⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)，下劃線(xiàn)部分為HA標(biāo)簽序列 (序列詳見(jiàn)表1)。用荷斯坦牛血樣2.5 mL提取總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。目的片段的PCR擴(kuò)增體系為：cDNA 2 μL，10×緩沖液2 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，前述上下游引物各 10 pmol/L，1.25 U PrimeSTAR?HS DNA聚合酶，超純水補(bǔ)足到20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃ (降低2 ℃/2循環(huán)) 退火40 s以及72 ℃延伸100 s，共16個(gè)循環(huán)；然后95 ℃變性30 s，51 ℃退火40 s以及72 ℃延伸100 s共19個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5min，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。目的片段和pLEX-MCS載體分別用HⅠ和Ⅰ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物進(jìn)行克隆，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pLEX-BPI和pLEX-BPI714。

1.3 穩(wěn)定表達(dá)牛BPI和BPI N端的mHEK293細(xì)胞的獲得

1.3.1 BPI、BPI714重組慢病毒的制備

采用磷酸鈣方法分別將pLEX-BPI /pLEX-BPI714質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，分別獲得攜帶和基因的重組病毒。步驟如下：293T細(xì)胞于10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%?80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑包括pLEX-BPI/pLEX-BPI714質(zhì)粒20 μg，包裝質(zhì)粒pSPAX 15 μg、pMD2G 6 μg，去離子水補(bǔ)足500 μL，加入2 × HBS (0.273 mol/L NaCl，10 μmol/L KCl，1.4 μmol/L Na2HPO4， 42 μmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸及10 μmol/L葡萄糖，pH 7.05) 500 μL，2.5 mol/L CaCl2溶液50 μL。室溫孵育20 min后，將混合液均勻滴加至生長(zhǎng)293T細(xì)胞培養(yǎng)基中。12?14 h后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收獲含病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)液，分裝保存于?70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714 mHEK293細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定

將pLEX-BPI/pLEX-BPI714重組慢病毒感染mHEK293細(xì)胞。步驟如下，在6孔板每孔各鋪3×105個(gè)mHEK293細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，將pLEX-BPI/pLEX-BPI714重組慢病毒0.5 mL和DMEM培養(yǎng)液0.5 mL混合，同時(shí)加入聚凝胺 (Polybrene) 10 μg，16 h換液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)基中添加600 ng/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得表達(dá)牛源基因的細(xì)胞系mHEK293-BPI和mHEK293-BPI714。

BPI/BPI714基因在mHEK293中的表達(dá)鑒定。分別收集mHEK293-BPI和mHEK293-BPI714細(xì)胞，裂解后取40 μg總蛋白按文獻(xiàn)[13]進(jìn)行Western blotting分析，其中一抗為1∶5 000小鼠抗HA抗體。

1.4 穩(wěn)定表達(dá)BPI基因?qū)PS介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

6孔板中分別培養(yǎng)3×105個(gè)/孔穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714和未表達(dá)BPI/BPI714的mHEK293細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，添加LPS (終濃度100 ng/mL)，分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組0、1、3、6、12、24、36和48 h共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)平行樣品。通過(guò)定量RT-PCR檢測(cè)上述細(xì)胞中相關(guān)炎性細(xì)胞因子相對(duì)表達(dá)量的變化。

1.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相對(duì)定量法對(duì)基因mRNA水平進(jìn)行定量RT-PCR分析。首先分別制備目的基因的標(biāo)準(zhǔn)品。針對(duì)人、、、、和基因，設(shè)計(jì)相應(yīng)的跨內(nèi)含子引物 (表1)。將PCR獲得的目的片段克隆至pMD-20-T載體，使用RⅠ內(nèi)切酶獲得線(xiàn)性化質(zhì)粒。經(jīng)DNA純化試劑盒 (QIAGEN) 純化線(xiàn)性化質(zhì)粒DNA，梯度稀釋至1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL共7個(gè)濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品。使用QuantiTect SYBR Green Ⅰ試劑進(jìn)行定量RT-PCR，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

表1 基因克隆及定量RT-PCR檢測(cè)的引物序列

The underlined sequences are the HA peptide tag sequences.

1.5.2 樣本的制備及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

用Trizol提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣品總RNA，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μL cDNA進(jìn)行定量RT-PCR，選擇作為內(nèi)參基因。反應(yīng)程序均為：95 ℃ 15 min，55個(gè)循環(huán)：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。溶解曲線(xiàn)：99 ℃ 10 s，40 ℃ 15 s，99 ℃0.1 ℃/s，降溫至40 ℃ 30 s。反應(yīng)體系：2×Master mix 10 μL；上下游引物 (10 pmol/L) 1 μL；cDNA 2 μL；無(wú)RNA酶超純水 7 μL。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.5.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析。當(dāng)結(jié)果顯示表達(dá)差異顯著時(shí) (<0.05)，在圖上用不同字母a、b、c表示；當(dāng)結(jié)果顯示表達(dá)差異不顯著時(shí) (>0.05)，在圖上用相同字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPI/BPI714慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

以荷斯坦牛血樣總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得1 449 bp和714 bp的CDS全長(zhǎng)和N端目的片段。隨即分別將目的片段克隆到pLEX-MCS表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切鑒定后，對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，獲得的目的片段序列正確，且基因序列準(zhǔn)確插入載體的預(yù)定位置。

2.2 獲得穩(wěn)定表達(dá)BPI的mHEK293細(xì)胞系

將攜帶牛源BPI/BPI714的重組病毒感染mHEK293細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714的mHEK293細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)BPI/BPI714在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在55 kDa和25 kDa標(biāo)準(zhǔn)分子量附近有特異的目的蛋白，說(shuō)明BPI/BPI714在mHEK293細(xì)胞中表達(dá) (圖1)。

2.3 穩(wěn)定表達(dá)的BPI/BPI714對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

為了研究重組BPI/BPI714蛋白對(duì)LPS介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的影響，以穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714 mHEK239細(xì)胞為細(xì)胞模型，用LPS分別刺激BPI/BPI714 mHEK239的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和不表達(dá)BPI/BPI714的mHEK239對(duì)照組細(xì)胞，分析不同細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后炎癥因子表達(dá)的變化。分別收集LPS刺激前、刺激后不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，制備細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得相應(yīng)cDNA。通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的炎癥因子、和以及轉(zhuǎn)錄因子和共5個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量。

2.3.1 穩(wěn)定表達(dá)的BPI/BPI714對(duì)LPS誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平的影響

對(duì)于沒(méi)有表達(dá)BPI或BPI714mHEK293細(xì)胞，LPS刺激6 h后，基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平升高 (<0.05)，隨后下降至與對(duì)照差異不顯著，之后的時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)量雖有小幅波動(dòng)，但均與刺激前差異不顯著。相比，無(wú)論表達(dá)BPI或BPI714，LPS刺激1 h后表達(dá)BPI/BPI714的細(xì)胞中基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高 (>0.05)，隨后下降，之后各時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)量和刺激前相比，差異均不顯著 (>0.05) (圖2)。

圖1 Western blotting檢測(cè)重組蛋白BPI /BPI714的表達(dá)

圖2 LPS刺激前后穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714和未表達(dá)BPI/BPI714的mHEK293細(xì)胞中IL-1β基因的相對(duì)表達(dá)水平

2.3.2 穩(wěn)定表達(dá)的BPI/BPI714對(duì)LPS誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平的影響

LPS刺激1 h后，沒(méi)有表達(dá)BPI或BPI714的mHEK293細(xì)胞中基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平迅速升高 (<0.05)，隨后的時(shí)間點(diǎn)逐漸下降，并在36 h后降到與對(duì)照差異不顯著。而表達(dá)BPI和BPI714的細(xì)胞在LPS刺激后，基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平相比LPS刺激前沒(méi)有顯著變化 (>0.05) (圖3)。

圖3 LPS刺激前后穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714和未表達(dá)BPI/BPI714的mHEK293細(xì)胞中TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)水平

2.3.3 穩(wěn)定表達(dá)的BPI/BPI714對(duì)LPS誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平的影響

LPS刺激1 h后，沒(méi)有表達(dá)BPI或BPI714的mHEK293細(xì)胞中基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平即顯著升高 (<0.05)，到3 h達(dá)到最高點(diǎn)，而后逐漸下降，刺激36和48 h后基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)與刺激前相比無(wú)顯著變化 (>0.05)。與表達(dá)BPI或BPI714的細(xì)胞相比，基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平在LPS刺激前后沒(méi)有顯著變化 (>0.05) (圖4)。

2.3.4 穩(wěn)定表達(dá)的BPI/BPI714對(duì)LPS誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平的影響

沒(méi)有表達(dá)BPI或BPI714的mHEK293細(xì)胞在LPS刺激后1 h、3 h和6 h，基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平迅速、持續(xù)升高，維持較高的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，與刺激前相比，差異顯著 (<0.05)。LPS刺激12 h時(shí)，基因表達(dá)水平下降至刺激前水平 (>0.05)，刺激24 h時(shí)其表達(dá)水平再次升高，較LPS刺激前的表達(dá)水平差異顯著，隨后在36 h和48 h又恢復(fù)到刺激前的表達(dá)水平 (>0.05)。與此同時(shí)，表達(dá)BPI和BPI714的mHEK293細(xì)胞，其基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平LPS刺激前和刺激后沒(méi)有顯著變化 (>0.05) (圖5)。

2.3.5 穩(wěn)定表達(dá)的BPI/BPI714對(duì)LPS誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平的影響

在沒(méi)有表達(dá)BPI或BPI714的mHEK293細(xì)胞中，LPS刺激后基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)升高，在刺激后3 h的表達(dá)量與刺激前相比差異顯著，然后逐漸下降，并在刺激12 h后表達(dá)水平降低至刺激前的表達(dá)水平。在表達(dá)BPI和BPI714的細(xì)胞中，的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平在LPS刺激1 h時(shí)升高，與刺激前顯著差異；隨后下降，刺激3 h、6 h后基因轉(zhuǎn)錄水平降至刺激前的表達(dá)水平；之后表達(dá)量持續(xù)下降，顯著低于刺激前的表達(dá)水平 (圖6)。

圖4 LPS刺激前后穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714和未表達(dá)BPI/BPI714的mHEK293細(xì)胞中IL-8基因的相對(duì)表達(dá)水平

圖5 LPS刺激前后穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714和未表達(dá)BPI/BPI714的mHEK293細(xì)胞中NF-κB-2基因的相對(duì)表達(dá)水平

圖6 LP S刺激前后穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714和未表達(dá)BPI/BPI714的mHEK293細(xì)胞中NF-κB-1基因的相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

LPS是革蘭氏陰性菌菌膜的組成部分，可以導(dǎo)致急性炎癥反應(yīng)，清除LPS或?qū)PS的脫毒是機(jī)體免疫反應(yīng)的最重要目標(biāo)。激活免疫反應(yīng)首先需要把單個(gè)LPS分子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的表面識(shí)別受體TLR4，這個(gè)過(guò)程需要LBP和革蘭氏陰性菌菌膜上的LPS結(jié)合，由LBP把內(nèi)毒素單體轉(zhuǎn)移給可溶的CD14 (或細(xì)胞膜上的CD14) 形成復(fù)合物，該復(fù)合物的結(jié)合底物是MD2或MD2-TLR4，然后由MD2將內(nèi)毒素和TLR4結(jié)合起來(lái)，通過(guò)激活NF-κB途徑，使巨噬細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子，如、和等，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，從而清除細(xì)菌[14]。

IL-8可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞等。、和LPS是刺激分泌的主要誘導(dǎo)劑。主要生物學(xué)功能是趨化和激活中性粒細(xì)胞，使其產(chǎn)生處理細(xì)胞毒素的吞噬小泡[4]。吞噬小泡中包括大量的抗菌肽、活性氧以及骨髓分化的蛋白，能夠消滅病原菌，清除LPS或?qū)PS進(jìn)行脫毒化處理，其中BPI是抗菌肽處理LPS的主要成分之一。

自1978年Weiss等提取天然BPI分子后，人們已經(jīng)對(duì)兔、鼠、豬、牛和雞等多種生物的基因進(jìn)行研究，大部分研究主要集中在基因多態(tài)性對(duì)其功能的影響[15-17]，以及不同組織的BPI表達(dá)分布以及其對(duì)革蘭氏陰性菌的殺菌能力方面。徐俊杰等[18]從細(xì)菌培養(yǎng)和平板計(jì)數(shù)上，都證實(shí)BPI有極強(qiáng)的抑菌效果。在全血實(shí)驗(yàn)中，5 nmol/L濃度的nBPl55或rBPl23就可使對(duì)血清和吞噬作用具有抵抗力的有莢膜粗糙型大腸桿菌發(fā)生損傷[1]。Eckert等[19]通過(guò)表達(dá)TLR4信號(hào)通路的HEK293細(xì)胞研究小鼠BPI的功能，發(fā)現(xiàn)鼠源BPI能特異的抑制IL-8和基因的表達(dá)。Wittmann等[20]在穩(wěn)定表達(dá)基因的RAW細(xì)胞系 () 中研究BPI對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)鼠源BPI可以抑制，IL-8和TNF基因的表達(dá)。綜上所述，LPS刺激后，炎性細(xì)胞因子、、和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平均顯著增加。因此，我們認(rèn)為通過(guò)分析這些基因的表達(dá)水平變化能夠判斷BPI對(duì)LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響作用。為此本實(shí)驗(yàn)選擇了上述炎性細(xì)胞因子/轉(zhuǎn)錄因子，利用具有TLR4信號(hào)通路的mHEK293細(xì)胞系，將牛源BPI/BPI N端基因分別轉(zhuǎn)染到上述mHEK293細(xì)胞中，在相同LPS刺激條件下，通過(guò)比較穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和沒(méi)有表達(dá)BPI/BPI714對(duì)照組細(xì)胞中這些因子的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平變化情況，評(píng)價(jià)牛源對(duì)LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響。

不同劑量的LPS刺激不同物種的免疫細(xì)胞、炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平變化并不完全相同。Strandberg等[21]采用50 μg/mL的LPS刺激牛乳腺上皮細(xì)胞，炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平均迅速提高，其中和的轉(zhuǎn)錄水平在2 h后最高，而在刺激8 h后達(dá)到最高轉(zhuǎn)錄水平。而Hadley等[22]采用1 ng/mL的LPS刺激人的血液，發(fā)現(xiàn)在6 h后表達(dá)水平達(dá)到最高，在12 h達(dá)到最高水平，則在24 h時(shí)達(dá)到最高水平。Guillermo等[23]對(duì)人的單核細(xì)胞系THP-1用LPS (100 ng/mL) 進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量迅速升高，并在4 h后達(dá)到最高水平，隨后緩慢下降。Lee等[24]用大腸桿菌刺激奶牛個(gè)體，采集牛奶中的細(xì)胞，檢測(cè)炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著升高，而在16 h后轉(zhuǎn)錄水平顯著升高 (<0.05)，而后逐漸下降?？傮w上，在LPS刺激的各種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，盡管炎性細(xì)胞因子表達(dá)在變化強(qiáng)度和時(shí)間上存在差異，但是炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平都會(huì)顯著高于其刺激前的轉(zhuǎn)錄水平。本研究結(jié)果也顯示，沒(méi)有BPI/BPI714表達(dá)時(shí)，LPS刺激mHEK293細(xì)胞后，、和以及轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平均顯著提高，說(shuō)明LPS可以誘導(dǎo)mHEK293產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子應(yīng)答。然而，當(dāng)穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714 mHEK293細(xì)胞受到相同LPS刺激細(xì)胞后，其、和的轉(zhuǎn)錄水平均接近刺激前的轉(zhuǎn)錄水平，都未發(fā)生顯著變化，說(shuō)明BPI能強(qiáng)烈抑制以上基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這一結(jié)果與Eckert等[19]和Wittmann等[20]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明不同物種的BPI抗菌機(jī)理是相似的。然而，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到表達(dá)BPI/BPI714的細(xì)胞在LPS刺激后6 h，其中的表達(dá)與對(duì)照組細(xì)胞相比也顯著降低，但該基因在LPS刺激后1 h的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平卻比刺激前顯著升高了，提示在LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子應(yīng)答中基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與和可能不完全相同。此外，不表達(dá)BPI/BPI714的細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后基因轉(zhuǎn)錄水平并沒(méi)有顯著提高，而穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714的細(xì)胞在LPS刺激后1 h，基因轉(zhuǎn)錄水平卻顯著升高，說(shuō)明基因在LPS刺激的炎性反應(yīng)中不起主要作用。

本研究分別構(gòu)建了牛BPI和BPI N端編碼序列的表達(dá)載體并導(dǎo)入mHEK293細(xì)胞中使其成功表達(dá)，收集LPS刺激前后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣品，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)、、、和基因的表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果表明，LPS刺激后，沒(méi)有表達(dá)BPI/BPI714的細(xì)胞中、、、表達(dá)水平在不同時(shí)間點(diǎn)均顯著提高 (<0.05)，并呈現(xiàn)規(guī)律性變化；而穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714細(xì)胞在同樣刺激條件下，、、、基因在LPS刺激前后的轉(zhuǎn)錄水平均沒(méi)有顯著變化 (>0.05)。說(shuō)明在mHKE293細(xì)胞模型中，穩(wěn)定表達(dá)BPI/BPI714的細(xì)胞能強(qiáng)烈抑制LPS介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了BPI/BPI714均能抑制LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，這為將來(lái)研究抗菌蛋白的抗菌效果提供了一種可靠的方法，也為進(jìn)一步研究其抑菌機(jī)制、開(kāi)發(fā)利用其抑菌功能提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Effects on the expression of lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokines mediated by bovine bactericidal/ permeability-increasing protein

Nan Yao1,2,4*, Jie Bai1,3*, Xuemei Zhang1, Ning Zhang1, Weidong Wu2, and Wenrong Li1

1 Key Laboratory of Genetics, Breeding and Reproduction of Grass Feeding Livestock, Ministry of Agriculture, the Key Laboratory of Animal Biotechnological of Xinjiang, Biotechnological Center, Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830000, Xinjiang, China 2 Clinical Research Center, Xinjiang People’s Hospital, Urumqi 830000, Xinjiang, China 3 Institurte of Amimal Science of Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China 4 Karamay City People's Hospital, Karamay 834000, Xinjiang, China

Bactericidal/permeability-increasing protein () can bind to and specifically neutralize lipopolysaccharide (LPS) from the outer membrane of Gram-negative bacteria. In order to evaluate potent LPS-neutralizing activity of bovine BPI, the full-length coding sequence (1 449bp) or 714 bp N-terminal coding sequence () of bovine BPI was transfected into mHEK293 cells and the expression of LPS-induced inflammatory cytokines was studied. First, we constructed the lentiviral expression vectors and generated mHEK293 cells stably expressing recombinant bovine BPI or BPI714. Then, we detected the expression of,,,andgenes by real-time PCR at 0, 1, 3, 6, 12, 24, 36 and 48 h post of LPS induction in cells with or without recombinant bovine BPI or BPI714 ectopic expression, respectively. In response to LPS, the robust abundance of inflammatory cytokines including,,andwas observed in wild type mHEK293 cells at eachtime point. On the contrary, mRNA abundance of,and

bactericidal/permeability-increasing protein, lipopolysaccharide, immune respond, inflammatory cytokines

April 4, 2014; Accepted: October 20, 2014

Wenrong Li. Tel: +86-991-4832343; Fax: +86-991-4833671; E-mail: xjlwr@126.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30860183).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 30860183) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-11-18

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140207.html

*These authors contributed equally to this study.