劉艷濤，洪煬，張旻,2，韓倩，曹曉丹，李莎，陸珂，李浩，傅志強(qiáng)，林矯矯,3

?

日本血吸蟲(chóng)基因的克隆、表達(dá)及其重組蛋白免疫保護(hù)效果分析

劉艷濤1，洪煬1，張旻1,2，韓倩1，曹曉丹1，李莎1，陸珂1，李浩1，傅志強(qiáng)1，林矯矯1,3

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241 2 河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 河南洛陽(yáng) 471023 3 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009

劉艷濤, 洪煬, 張旻, 等. 日本血吸蟲(chóng)SjOST48基因的克隆、表達(dá)及其重組蛋白免疫保護(hù)效果分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(4): 501–511.Liu YT, Hong Y, Zhang M, et al. Cloning, expression of gene SjOST48 from Schistosoma japonicum and evaluation of the immunoprotective efficacy of rSjOST48 in mice. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 501–511.

為了鑒定日本血吸蟲(chóng)43基因并評(píng)估其重組蛋白作為新的血吸蟲(chóng)病候選疫苗抗原的潛力，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增日本血吸蟲(chóng)基因，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析該基因在日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體的轉(zhuǎn)錄水平，以pET-28a(+) 為載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒并誘導(dǎo)其在大腸桿菌中表達(dá)。將純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備免疫血清，利用Western blotting檢測(cè)重組蛋白的免疫原性，應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)對(duì)進(jìn)行蛋白組織定位，利用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中特異性抗體水平。將重組抗原免疫小鼠，評(píng)估其免疫保護(hù)效果。PCR擴(kuò)增得到1 248 bp不含信號(hào)肽的cDNA序列，同源性分析結(jié)果顯示，該基因?yàn)槿毡狙x(chóng)寡糖轉(zhuǎn)移酶OST48亞基，命名為。實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示在檢測(cè)的童蟲(chóng)和成蟲(chóng)各個(gè)期別蟲(chóng)體中均有轉(zhuǎn)錄，其中在28 d蟲(chóng)體中的轉(zhuǎn)錄水平最高，在42 d雌蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄量顯著高于雄蟲(chóng)。構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SjOST48成功在大腸桿菌中表達(dá)，重組蛋白rSjOST48分子量約50 kDa。Western blotting分析表明rSjOST48能被小鼠免疫血清識(shí)別，具有良好的免疫原性，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明SjOST48蛋白主要分布于蟲(chóng)體體被，少量分布于實(shí)質(zhì)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明rSjOST48能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體。動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SjOST48能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生32.62% (<0.05) 的減蟲(chóng)率及57.61% (<0.01) 的肝臟減卵率。本研究為深入探討日本血吸蟲(chóng)基因的生物學(xué)功能及篩選新的血吸蟲(chóng)疫苗候選分子奠定了基礎(chǔ)。

日本血吸蟲(chóng)，基因，表膜蛋白，免疫保護(hù)效果

血吸蟲(chóng)病(Schistosomiasis) 是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病，在全球76個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，受感染人數(shù)高達(dá)2億。截至2012年底，我國(guó)仍有45個(gè)血吸蟲(chóng)病流行縣 (市、區(qū))，血吸蟲(chóng)病人總數(shù)多達(dá)240 597例[1]。目前血吸蟲(chóng)病防治仍以吡喹酮化療為主，但化療可能誘導(dǎo)抗藥性產(chǎn)生，具有潛在產(chǎn)生耐藥性的危險(xiǎn)，且藥物治療無(wú)法控制重復(fù)感染，因此血吸蟲(chóng)病新型疫苗及新藥相關(guān)研究已成為目前血吸蟲(chóng)病防治研究的重大需求。

血吸蟲(chóng)的體被表膜暴露于蟲(chóng)體表面，是血吸蟲(chóng)和宿主物質(zhì)交換的場(chǎng)所也是宿主免疫效應(yīng)分子與蟲(chóng)體直接接觸的界面，被認(rèn)為與血吸蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)攝取、免疫逃避、免疫調(diào)節(jié)、排泄、滲透壓調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切相關(guān)[2]，而分布于體被上的表膜蛋白是研發(fā)疫苗和藥物的理想靶標(biāo)。目前研究發(fā)現(xiàn)Sj23、Sm-TSP-2和Sj29等表膜蛋白可作為抗血吸蟲(chóng)病疫苗候選分子[3-4]，但其產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果仍需提高，篩選誘導(dǎo)更高免疫保護(hù)效果的疫苗候選分子是血吸蟲(chóng)病預(yù)防取得突破的基礎(chǔ)。

2006年Liu等[5]在通過(guò)蛋白組學(xué)分析日本血吸蟲(chóng)與宿主互作研究和本實(shí)驗(yàn)室Zhang等[6]在對(duì)日本血吸蟲(chóng)體被蛋白進(jìn)行蛋白組學(xué)分析時(shí)都鑒定到了SJCHGC01743蛋白。同源性分析結(jié)果顯示該蛋白與哺乳動(dòng)物的寡糖轉(zhuǎn)移酶中的一個(gè)亞基DDOST/OST48高度同源，命名為SjOST48。DDOST/OST48是寡糖轉(zhuǎn)移酶 (OST) 復(fù)合體中的一個(gè)亞基[7]，屬于寡糖轉(zhuǎn)移酶48 kDa亞家族，它能夠跨過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜催化高甘露糖型寡糖 (Dolichol-P-GlcNac2Man9Glc3) 從多萜醇聯(lián)糖載運(yùn)脂體轉(zhuǎn)運(yùn)到新生肽鏈的糖基化識(shí)別位點(diǎn) (Asn-X-Ser/Thr) 的天冬酰胺受體部位上[8]，參與新生蛋白質(zhì)N-連接糖基化修飾過(guò)程。N-連接糖基化普遍發(fā)生在細(xì)胞外環(huán)境的蛋白質(zhì)中，包括膜蛋白、分泌蛋白和體液中蛋白質(zhì)，而這些蛋白恰巧都是容易獲得并適合用作診斷和治療的分子，因此，許多臨床的生物標(biāo)志物及治療的靶標(biāo)常是糖蛋白[9]。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)鑒定得到SjOST48，推測(cè)其參與了蛋白質(zhì)N-糖基化修飾作用，可能在血吸蟲(chóng)發(fā)育、繁殖與蛋白運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用[6]。本研究對(duì)SjOST48編碼基因進(jìn)行克隆、表達(dá)，評(píng)估重組蛋白rSjOST48在小鼠中誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果，為深入研究該基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和酶

Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購(gòu)自Invitrogen公司；ExDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；Ni-NTA HisBind Resin (Merck-Novagen) 購(gòu)自中科新生命生物科技有限公司；硝酸纖維素膜 (Whatman) 購(gòu)自經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (H+L) 購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)研究所；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG1、IgG2a購(gòu)自AbD Serotech公司；DAB顯色試劑盒、可溶性單組分TMB購(gòu)自天根生物科技有限公司。

1.1.2 菌種、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和寄生蟲(chóng)

大腸桿菌DH5α、BL21，表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)，日本血吸蟲(chóng)42 d成蟲(chóng)cDNA均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物血吸蟲(chóng)病研究室保存；中國(guó)大陸株安徽品系的血吸蟲(chóng)陽(yáng)性釘螺由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供；雄性新西蘭白兔，體重2.5?3.0 kg，購(gòu)自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)；6周齡雄性BALA/c小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 蟲(chóng)體的收集

新西蘭白兔分別以腹部貼片法感染20 000、15 000、10 000、8 000、5 000、2 000條血吸蟲(chóng)尾蚴，在感染后7、14、21、28、35和42 d后剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲(chóng)體，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取

取液氮中凍存的7、14、21、28、35和42 d日本血吸蟲(chóng)各200 mg，按Trizol試劑盒說(shuō)明書分別進(jìn)行總RNA的提取。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和含ORF cDNA片段的擴(kuò)增

參照NCBI收錄的日本血吸蟲(chóng)(gb|AY813753.1|) 核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件分析并設(shè)計(jì)引物，分別在上、下游引物的5′端引入Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。引物序列見(jiàn)表1，引物由上海華津生物技術(shù)有限公司合成。取1 μL 42 d成蟲(chóng)cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在不同時(shí)期蟲(chóng)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平

分別提取日本血吸蟲(chóng)7、14、21、35、42 d及雌雄蟲(chóng)體的總RNA，去除基因組DNA后按Prime ScriptTMRT reagent kit試劑盒操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄獲得日本血吸蟲(chóng)各時(shí)期的cDNA。以日本血吸蟲(chóng)基因?yàn)閮?nèi)參，以不同期別的日本血吸蟲(chóng)cDNA為模板，采用SYBR Premix ExTM進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。和Sj的實(shí)時(shí)定量PCR引物序列見(jiàn)表1，預(yù)期擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度分別為162 bp和213 bp。引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物使用濃度為10 pmol/μL。

1.2.5 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SjOST48的構(gòu)建

以日本血吸蟲(chóng)42 d成蟲(chóng)cDNA作為模板，利用ExDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增編碼SjOST48的cDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)A型DNA快速純化試劑盒純化后，亞克隆到pMD19-T載體中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，取陽(yáng)性單克隆測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMD19-T-SjOST48和表達(dá)載體pET-28a(+)進(jìn)行雙酶切后，用T4 DNA連接酶構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SjOST48。

1.2.6 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的純化

將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SjOST48轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定及酶切鑒定正確后，接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至大腸桿菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入 1 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。用8 mol/L尿素溶解重組蛋白，利用Ni-NTA HisBind Resin層析柱(Merk公司)在變性條件下分離純化重組蛋白，經(jīng)含不同梯度濃度尿素 (5、4、3、2、1、0 mol/L)的PBS逐步透析復(fù)性。

表1 PCR和qPCR引物

1.2.7 動(dòng)物免疫與免疫血清制備

選擇6?8周齡 (SPF級(jí)) BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分成3組，每組10只，分別為免疫組、佐劑對(duì)照組和空白對(duì)照組。免疫組每次每只注射100 μL含206佐劑和20 μg純化的SjOST48重組蛋白的乳化液；佐劑對(duì)照組每次每只注射100 μL 206佐劑和PBS的乳化液；空白對(duì)照組每次每只注射100 μL的PBS。免疫間隔時(shí)間為2周，共免疫3次。第3次免疫后2周，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染40±1條日本血吸蟲(chóng)尾蚴。分別在免疫前和每次免疫后第8天對(duì)每組小鼠進(jìn)行眼靜脈采血，制備免疫血清。

1.2.8 重組蛋白的免疫原性分析

將10 μg重組蛋白rSjOST48進(jìn)行SDS-PAGE后低溫電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 (130 mA，1 h)，分別以重組蛋白免疫的BALB/c小鼠血清、免疫前健康BALB/c小鼠血清室溫孵育2 h，PBST 洗滌3次，羊抗鼠IgG-HRP室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，用二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 進(jìn)行底物顯色。

1.2.9 SjOST48蛋白的蟲(chóng)體組織定位分析

將日本血吸蟲(chóng)35 d蟲(chóng)體?20 ℃包埋固定，制成8 μm的冰凍切片備用。用丙酮將蟲(chóng)體組織固定30 min，PBST洗滌3次，以重組蛋白免疫的小鼠血清室溫孵育2 h；洗滌3次，以免疫前小鼠血清作為陰性對(duì)照。Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG (H+L) 室溫孵育1 h，洗滌后用DAPI (10 μg/mL) 溶液室溫避光復(fù)染8 min，置熒光顯微鏡下觀察蛋白的分布情況。

1.2.10 ELISA 檢測(cè)免疫小鼠血清抗SjOST48特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體水平

以純化的重組蛋白rSjOST48為抗原，以1.2.7中制備的免疫血清為一抗，利用間接ELISA方法檢測(cè)3組小鼠免疫前后血清中抗SjOST48特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體效價(jià)變化。以包被緩沖液稀釋抗原濃度至10 μg/mL，包被96孔ELISA板，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜，用PBST洗滌3次后，每孔加入150 μL PBST-1.5%牛血清白蛋白(BSA) 進(jìn)行封閉，37 ℃孵育2 h。PBST洗滌3次，被檢血清按1∶100稀釋后每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，羊抗小鼠IgG-HRP (北京碧云天生物技術(shù)研究所) 1∶1 000稀釋，羊抗小鼠IgG1-HRP和IgG2a-HRP (AbD Serotec，UK) 按1∶4 000稀釋后作二抗 (100 μL/孔)，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，然后加入可溶性TMB底物100 μL，) 避光顯色5 min，加入2 mol/L H2SO4(50 μL/孔) 終止反應(yīng)，用BioTek公司的酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值。

1.2.11 小鼠減蟲(chóng)率和減卵率計(jì)算

末次免疫2周后，每只小鼠用腹部貼片法感染尾蚴40±1條。攻擊尾蚴6周后解剖小鼠，肝門靜脈沖洗法收集成蟲(chóng)并記數(shù)，同時(shí)收集每只小鼠的肝臟。稱取肝組織0.5 g，剪碎后加 10 mL 5% NaOH，組織勻漿器勻漿，置56 ℃水浴消化15 min，混勻，吸取50 μL的懸液3份，鏡檢計(jì)數(shù)肝組織蟲(chóng)卵。按以下公式計(jì)算減蟲(chóng)率、肝臟減卵率 (EPG為平均每克肝組織中所負(fù)荷蟲(chóng)卵數(shù))。

減蟲(chóng)率=(1?免疫組平均蟲(chóng)荷數(shù)/對(duì)照組平均蟲(chóng)荷數(shù))×100%；

肝臟減卵率=(1?免疫組EPG/對(duì)照組EPG)×100%。

1.2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPASS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(Duncan法)。對(duì)有3個(gè)數(shù)值以上的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，求標(biāo)準(zhǔn)差；對(duì)兩組以上數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，分析各組數(shù)據(jù)之間的差異是否顯著。

2 結(jié)果

2.1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

參照NCBI收錄的日本血吸蟲(chóng)(gb|AY813753.1|) 核苷酸序列設(shè)計(jì)特異引物，以日本血吸蟲(chóng)42 d成蟲(chóng)cDNA為模板PCR擴(kuò)增其ORF，得到大小為1 248 bp的特異片段 (圖1)，與預(yù)期目的片段大小相符，與參考序列相比存在5個(gè)核苷酸和3個(gè)氨基酸的差異。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，的ORF含1 299個(gè)核苷酸，由433個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為48 696.6，理論等電點(diǎn)為5.14。該氨基酸序列的N端有一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)信號(hào)肽，存在一個(gè)糖基化位點(diǎn)Asn51。利用NCBI的Blast 軟件對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果顯示該基因編碼蛋白與日本血吸蟲(chóng)DDOST/OST48蛋白具有高度同源性，氨基酸序列相似性高達(dá)98%。推測(cè)該蛋白為日本血吸蟲(chóng)OST48蛋白，命名為SjOST48。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2在不同時(shí)期蟲(chóng)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平分析

Real time PCR分析結(jié)果表明，在日本血吸蟲(chóng)的7、14、21、28、35和42 d蟲(chóng)體中均有轉(zhuǎn)錄，其中28 d蟲(chóng)體轉(zhuǎn)錄量最高，其次是7 d、21 d、35 d，14 d蟲(chóng)體轉(zhuǎn)錄量最低。28 d和42 d蟲(chóng)體轉(zhuǎn)錄量與14 d蟲(chóng)體轉(zhuǎn)錄量相比，差異極顯著 (<0.01)；42 d雌蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄量顯著高于42 d雄蟲(chóng)，差異極顯著 (<0.01) (圖2)。

2.3基因在大腸桿菌中的表達(dá)及重組蛋白純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-28a(+)- SjOST48在大腸桿菌BL21 (DE3)中成功表達(dá)，得到一重組蛋白rSjOST48，重組蛋白分子質(zhì)量約為50 kDa，與預(yù)期大小相符 (圖3)。在IPTG誘導(dǎo)后1?4 h表達(dá)量隨時(shí)間增長(zhǎng)而增加，誘導(dǎo) 4 h后表達(dá)量達(dá)到最高并趨于穩(wěn)定。重組蛋白以包涵體形式存在，可溶解于8 mol/L尿素溶液中。經(jīng)過(guò)Ni-NTA His Bind Resin樹(shù)脂純化后，獲得了較純的重組蛋白，經(jīng)尿素梯度PBS逐步透析進(jìn)行蛋白復(fù)性。

2.4 重組蛋白的抗原性分析

將重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，經(jīng)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，分別用重組蛋白免疫的BALB/c小鼠血清、健康BALB/c小鼠血清作為一抗進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示用重組蛋白免疫的BALB/c小鼠血清作為一抗時(shí)，50 kDa處有一明顯的識(shí)別條帶，而陰性對(duì)照組在50 kDa處未有條帶出現(xiàn)，表明重組蛋白具有良好的抗原性 (圖4)。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR分析SjOST48在不同期別(A) 及不同性別(B)蟲(chóng)體中的轉(zhuǎn)錄水平差異

圖3 重組蛋白rSjOST48的表達(dá)分析

圖4 重組蛋白rSjOST48的免疫原性分析

2.5 rSjOST48蛋白在日本血吸蟲(chóng)體內(nèi)的組織定位

在熒光顯微鏡下可以觀察到Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗發(fā)出的紅色熒光以及DAPI復(fù)染核酸后發(fā)出的藍(lán)色熒光，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以免疫前小鼠血清孵育后，未見(jiàn)紅色熒光 (圖5A)，以重組抗原免疫小鼠血清孵育后，在日本血吸蟲(chóng)體被上出現(xiàn)紅色熒光，實(shí)質(zhì)部分也有少量紅色熒光分布 (圖5B)，表明SjOST48蛋白主要分布于體被，少量分布于實(shí)質(zhì)。

2.6 小鼠血清抗rSjOST48蛋白特異性抗體的檢測(cè)

用間接ELISA法檢測(cè)3組小鼠免疫前后血清抗rSjOST48特異性抗體IgG、IgG1和IgG2a效價(jià)變化，結(jié)果顯示重組蛋白第一次免疫小鼠后并沒(méi)有引起小鼠體內(nèi)特異性IgG抗體水平顯著升高，二免、三免后特異性抗體水平較206佐劑組極顯著升高 (<0.01)，在攻擊血吸蟲(chóng)尾蚴6周后其抗體水平達(dá)到最大值，與206佐劑組相比差異極顯著 (<0.01)；而佐劑對(duì)照組和空白對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中抗rSjOST48的特異性IgG抗體滴度均未出現(xiàn)明顯變化 (圖6)。同時(shí)，對(duì)抗rSjOST48蛋白特異性IgG1和IgG2a抗體滴度的測(cè)定結(jié)果表明，隨著3次免疫的進(jìn)行，206佐劑對(duì)照組IgG1和IgG2a抗體滴度沒(méi)有明顯變化，但rSjOST48蛋白免疫組IgG1抗體滴度二免后略有升高，而IgG2a特異性抗體在一免、二免后都沒(méi)有明顯變化，三免后IgG1、IgG2a抗體滴度均顯著升高，與206佐劑組相比差異極顯著 (<0.01)，且隨著免疫次數(shù)的增加，IgG1/IgG2a比值逐漸增高，二免以后IgG1抗體滴度一直高于IgG2a (表2)。

圖5 SjOST48蛋白在35 d日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體內(nèi)的定位分析(10×40)

圖6 小鼠血清抗rSjOST48特異性IgG抗體水平變化

2.7 動(dòng)物免疫保護(hù)效果

動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白rSjOST48誘導(dǎo)產(chǎn)生了部分的免疫保護(hù)效果(表3)。和PBS組比較，重組融合蛋白rSjOST48分別誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了32.62% (<0.05) 的減蟲(chóng)率以及57.61% (<0.01) 的肝臟減卵率，而佐劑對(duì)照組獲得的減蟲(chóng)率和減卵率分別為11.63%和1.51%，差異均不顯著。

3 討論

體被具有許多重要的生物功能，被認(rèn)為是診斷、疫苗和藥物的潛在靶點(diǎn)，而其上的表膜蛋白是執(zhí)行這些功能的分子基礎(chǔ)。所以，通過(guò)對(duì)血吸蟲(chóng)體被表膜蛋白的研究有可能發(fā)現(xiàn)新的疫苗和藥物靶標(biāo)，這可為血吸蟲(chóng)病防治提供新思路。實(shí)驗(yàn)證明，多種膜蛋白能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。例如，屬于四跨膜蛋白家族的SmTSP-2能夠誘導(dǎo)57%的減蟲(chóng)率和64%的肝臟減卵率[10]。定位于血吸蟲(chóng)體被中的Sm29能夠誘導(dǎo)51%的減蟲(chóng)率、60%的腸減卵率和50%的肝臟減卵率[11]。所以，鑒定并比較日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段的體被表膜蛋白有助于進(jìn)一步了解其免疫逃避機(jī)理以及發(fā)現(xiàn)新的疫苗候選分子和藥物靶標(biāo)[12]。

表2 小鼠血清抗rSjOST48特異性抗體亞型IgG1及IgG2a分析

Data are expressed as. ** (<0.01) indicates statistically significant difference compared to the group of mice immunized with ISA 206.

表3 重組蛋白rSjOST48誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果

本研究對(duì)日本吸血蟲(chóng)體被表膜蛋白SJCHGC01743進(jìn)行了克隆、表達(dá)、純化以及生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明SJCHGC01743和日本血吸蟲(chóng)寡糖轉(zhuǎn)移酶OST48亞基的同源性最高，達(dá)到98%，命名為SjOST48。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示基因在檢測(cè)的童蟲(chóng)和成蟲(chóng)各個(gè)期別蟲(chóng)體中均有轉(zhuǎn)錄，42 d雌蟲(chóng)的轉(zhuǎn)入量顯著高于雄蟲(chóng)，約為雄蟲(chóng)的4.7倍，表明是一個(gè)雌蟲(chóng)偏向基因，這與之前Fitzpatrick等[13]和Moertel等[14]的推測(cè)相吻合，是寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中起輔助催化作用的亞基[15]，提示雌雄蟲(chóng)的蛋白質(zhì)糖基化作用可能存在差異。間接免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SjOST48蛋白主要分布在日本血吸蟲(chóng)體被上，進(jìn)一步驗(yàn)證了Zhang等[6]等在日本血吸蟲(chóng)體被蛋白組學(xué)研究中有關(guān)此蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。Western blotting結(jié)果顯示重組抗原rSjOST48可被重組蛋白免疫血清識(shí)別，表明rSjOST48具有較好的抗原性。以rSjOST48重組抗原進(jìn)行小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示免疫小鼠成蟲(chóng)荷蟲(chóng)量減少了32.62%，肝臟蟲(chóng)卵數(shù)減少了57.61%，與空白對(duì)照組相比差異極顯著，表明SjOST48重組抗原在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了部分免疫保護(hù)效果，具有作為日本血吸蟲(chóng)疫苗候選分子的潛能。寡糖轉(zhuǎn)移酶是一個(gè)多亞基復(fù)合體，OST48作為其中的一個(gè)亞基，只用這一亞基的重組蛋白作為疫苗分子獲得的免疫保護(hù)效果可能有限，如果同時(shí)對(duì)OST復(fù)合體中其他亞基作為疫苗候選分子的潛力進(jìn)行探討，研制多價(jià)疫苗或多表位重組抗原疫苗，有可能進(jìn)一步提高候選疫苗的免疫保護(hù)效果。免疫應(yīng)答分析表明，rSjOST48能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的特異性IgG抗體水平，且隨著免疫次數(shù)增加，特異性抗體水平顯著升高，而空白對(duì)照組和佐劑對(duì)照組特異性IgG抗體水平一直維持在較低水平，推測(cè)重組蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果可能和其誘導(dǎo)的較高的特異性抗體水平有關(guān)。同時(shí)，對(duì)抗rSjOST48蛋白的特異性IgG1和IgG2a抗體進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示免疫組小鼠特異性IgG1和IgG2a抗體滴度呈上升趨勢(shì)，二免以后IgG1抗體滴度一直高于IgG2a，且IgG1/IgG2a比值逐漸增高。以往研究表明IgG2a主要激活Th1型輔助細(xì)胞，而IgG1主要促進(jìn)Th0前體細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化[16]，在血吸蟲(chóng)感染小鼠模型中，Th1型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)抗感染免疫保護(hù)力，而Th2型免疫應(yīng)答則主要與免疫病理?yè)p害有關(guān)[17]，因此，推測(cè)rSjOST48可能誘發(fā)小鼠以Th2型為主、抗日本血吸蟲(chóng)感染的Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答。綜上所述，基因值得作為潛在的日本血吸蟲(chóng)疫苗候選分子深入研究。本文為深入開(kāi)展SjOST48的生物學(xué)功能研究及抗血吸蟲(chóng)疫苗候選分子篩選提供了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Li SZ, Zheng H, Gao J, et al. Endemic status of schistosomiasis in People’s Republic of China in 2012. Chin J Schistoso Cont, 2013, 25(6): 557?563 (in Chinese).李石柱, 鄭浩, 高婧, 等. 2012年全國(guó)血吸蟲(chóng)病疫情通報(bào).中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志, 2013, 25(6): 557?563.

[2] Jones MK, Gobert GN, Zhang LH, et al. The cytoskeleton and motor proteins of human schistosomes and their roles in surface maintenance and host-parasite interactions. Bioessays, 2004, 26(7): 752?765.

[3] Tran MH, Pearson MS, Bethony JM, et al. Tetraspanins on the surface ofare protective antigens against schistosomiasis. Nature Med, 2006, 12(7): 835?840.

[4] Cardoso FC, Macedo GC, Gava E, et al.tegument protein Sm 29 is able to induce a Th1-type of immune response and protection against parasite infection. PLoS Negl Trop Dis, 2008, 2(10): 1?10.

[5] Liu F, Lu J, Hu W, et al. New perspectives on host-parasite interplay by comparative transcriptomic and proteomic analyses of. PLoS Pathogens, 2006, 2(4): 268–281.

[6] Zhang M, Hong Y, Han Y, et al. Proteomic analysis of tegument-exposed proteins of female and maleworms. J Proteome Res, 2013, 12(11): 5260–5270.

[7] Kelleher DJ, Karaoglu D, Mandon EC,et al. Oligosaccharyltransferase isoforms that contain different catalytic STT3 subunits have distinct enzymatic properties. Molecular Cell, 2003, 12(1): 101–111.

[8] Kelleher DJ, Gilmore R. An evolving view of the eukaryotic oligosaccharyltransferase. Glycobiology, 2006, 16(4): 47R–62R.

[9] Wang JH, Tong Y, Zhu Y, et al. The research progress in protein glycosylation. Pharm Biotechnol, 2011, 18(1): 77?80 (in Chinese).王家紅, 童玥, 朱玥, 等. 蛋白質(zhì)糖基化的研究進(jìn)展. 藥物生物技術(shù), 2011, 18(1): 77?80.

[10] Tran MH, Pearson MS, Bethony JM, et al. Tetraspanins on the surface ofare protective antigens against schistosomiasis. Nature Med, 2006, 12: 835–840.

[11] Cardoso FC, Macedo GC, Gava E, et al.tegument protein Sm29 is able to induce a Th1-type of immune response and protection against parasite infection. PLoS Negl Trop Dis, 2008, 2(10): e308.

[12] Qian MB. The structure and function of schistosome tegument and related proteomic study. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2008, 26(6): 466?471 (in Chinese). 錢門寶. 血吸蟲(chóng)體被的結(jié)構(gòu)功能及其蛋白質(zhì)組研究. 中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志, 2008, 26(6): 466?471.

[13] Fitzpatrick JM, Johnston DA, Williams GW, et al. An oligonucleotide microarray for transcriptome analysis ofand its application/use to investigate gender-associated gene expression. Mol Biochem Parasitol, 2005, 141(1): 1–13.

[14] Moertel L, McManus DP, Piva TJ, et al. Oligonucleotide microarray analysis of strain-and gender-associated gene expression in the human blood fluke,. Mol Cell Probes, 2006, 20(5): 280–289.

[15] Roboti P, High S. The oligosaccharyltransferase subunits OST48, DAD1 and KCP2 function as ubiquitous and selective modulators of mammalian N-glycosylation. J Cell Sci, 2012, 125(14): 3474?3484.

[16] Finkelman FD, Holmes J, Katona IM, et al. Lymphokine control ofimmunoglobulin isotype selection. Annu Rev Immunol, 1990, 8(1): 303?333.

[17] Sher A, Coffman RL, Hieny S, et al. Interleukin 5 is required for the blood and tissue eosinophilia but not granuloma formation induced by infection with. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(1): 61?65.

(本文責(zé)編郝麗芳)

Cloning, expression of genefromand evaluation of the immunoprotective efficacy of rSjOST48 in mice

Yantao Liu1, Yang Hong1, Min Zhang1,2, Qian Han1, Xiaodan Cao1, Sha Li1, Ke Lu1, Hao Li1, Zhiqiang Fu1, and Jiaojiao Lin1,3

1,,,,200241,2,,471023,,Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and ZoonosesYangzhouJiangsuChina

To identifygene ofand evaluate the potential of the recombinant protein as a new vaccine candidate for schistosomiasis, polymerase chain reaction (PCR) technique was used toamplify the cDNA of the gene and real-time RT-PCR was used to analyze the transcription profiles ofat different development stages. Recombinant plasmid was successfully constructed and transformed into competentBL21 (DE3). Then the recombinant protein was expressed, purified and emulsified with ISA206 adjuvant to immunize BALB/c mice for three times. Theimmunogenicity was confirmed by Western blotting and tissue localization was detected by indirect immunofluorescent assay. The specific antibody level was detected by ELISA. The immunoprotection of rSjOST48 was evaluated by the reduction in worm and egg countsin mice. A cDNA with 1 248 nucleotides was isolated from 28-day-old schistosomes cDNAs by PCR. Sequence analysis revealed thatwas a 48-kDa subunit of the oligosaccharyltransferase complex () and named as. Real-time PCR analysis indicated that this gene was expressed in all investigated stages and had the highest expression level in 28 d worms, the level of gene transcription in female worms was significantly higher than that of male worms. Then recombinant plasmid pET28a(+)-SjOST48 was successfully constructed and expressed inBL21 (DE3). Western blotting analysis showed that rSjOST48 had good immunogenicity. Indirect immunofluorescent analysis revealed that SjOST48 was mainly distributed on the tegument of the worms. The result of ELISA indicated that the rSjOST48 vaccinated group could induce a significant increase in the level of specific IgG, IgG1 and IgG2a. An immunoprotection experiment showed that the vaccination of rSjOST48 in mice induced 32.62% (<0.05) reduction in the numbers of worms and 57.61% (<0.01) in eggs in liver, compared with that of the control group. This study provides the foundation for proceeding further research on the biologicalfunction of SjOST48 and screening new vaccine candidates for schistosomiasis.

,gene, tegument protein, immunoprotective effect

August 20, 2014; Accepted:October 29, 2014

Jiaojiao Lin. Tel: +86-21-34293440; E-mail: jjlin@shvri.ac.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31172315, 81271871).

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31172315, 81271871)資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-11-17

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140420.html