楊藩，王亞嫻，杜麗霞，王華巖

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豬啟動子克隆及其調控活性檢測

楊藩1，王亞嫻1，杜麗霞2，王華巖1

1 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院陜西省干細胞工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100 2 西北農(nóng)林科技大學創(chuàng)新實驗學院，陜西楊凌 712100

楊藩, 王亞嫻, 杜麗霞, 等. 豬ESRRB啟動子克隆及其調控活性檢測. 生物工程學報, 2015, 31(4): 491–500.Yang F, Wang YX, Du LX, et al. Cloning and regulation of pig estrogen related receptor β gene (ESRRB) promoter. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 491–500.

(Estrogen related receptor β) 屬于雌激素受體家族，是一類在胚胎早期外胚層細胞中表達并對干細胞多能性維持起重要作用的基因。為了探索豬的表達和轉錄調控機制，克隆了3.3 kb啟動子片段，構建了相應的報告載體。并將報告載體分別轉染293T人胚腎細胞、Hela人宮頸癌細胞和小鼠C2C12成肌細胞。通過TFSEARCH和JASPER方法對啟動子潛在的轉錄調控位點進行分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子上有SMAD、STAT3、MYC、KLF4等多能轉錄因子的結合位點。將相應的轉錄因子與啟動子共轉染，并檢測報告基因熒光素酶的活性。結果顯示豬B啟動子具有明顯的組織特異性調控，同時SMAD對啟動子活性有較明顯的調控作用。進一步對3.3 kb片段進行了一系列的缺失，發(fā)現(xiàn)豬核心區(qū)域位于5′上游的?25 bp和?269 bp之間。研究結果表明豬啟動子上潛在的轉錄因子結合位點及啟動子核心區(qū)域是參與調控表達的重要序列。

豬，雌激素相關受體，啟動子，多能干細胞，轉錄調控

多能干細胞的自我更新需要相關信號通路和各種轉錄因子調控來維持，其中ERK、GSK、LIF等通路和Oct4、Sox2、Nanog等因子，在其中起著關鍵作用[1]。目前，小鼠胚胎干細胞 (ESCs) 可以在添加2i/LiF的培養(yǎng)基中穩(wěn)定傳代[2]，其中2i通過抑制ERK和GSK3通路發(fā)揮維持ESCs自我更新和多能性的作用。GSK3通過β-catein對許多基因起著負調控的作用，這其中就包括c-Myc[3-4]。同時，遺傳分析表明β-catein通過Tcf3協(xié)同作用負調控ESCs的自我更新[5]。為了明確Tcf3的下游靶基因，Simth研究團隊敲除了干細胞的基因，并結合Tcf3的調控位點發(fā)現(xiàn)雌激素相關受體b(Esrrb)是Tcf3的下游靶基因，對干細胞自我更新的維持起著重要的作用[6]。Chambers研究團隊在分析Nanog的下游靶基因時發(fā)現(xiàn)，Nanog可以激活Esrrb的表達并維持干細胞的自我更新[7]。同時，Esrrb或者Nanog的過表達可以在不添加LIF的條件下維持干細胞的自我更新。

雌激素相關受體(Estrogen related receptor) 屬于核受體家族。目前己發(fā)現(xiàn)3種亞型，即[8]、[8]、[9]。雌激素受體基因包含有相對保守的結構區(qū)域：配體結合域 (LBD) 和DNA結合域(DBD)[8,10]。該家族基因可以不經(jīng)過相應激素配體的刺激而直接入核并調控基因的表達。相對于和，的時空表達特異性較高。在小鼠胚胎發(fā)育到5.5 d時出現(xiàn)，并隨著胚胎的進一步發(fā)育而逐漸消失，其缺失會導致胚胎發(fā)育不正常[11-12]。因此，開展對該基因啟動子的研究，有助于揭示多能干細胞的自我更新維持和多向分化能力的調控機制。本研究為揭示豬基因在分子調控機理，分子克隆了啟動子片段，并對啟動子上的調控位點進行了系統(tǒng)分析，通過對豬啟動子缺失，用雙熒光素酶表達載體驗證了潛在轉錄因子對的調控。本研究為進一步探索對豬多能干細胞自我更新的維持和調控機理奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種、載體和細胞

感受態(tài)大腸桿菌DH5α、質粒pEGFP-1、pEGFP-C1、pGL3-Basic、pMX-OCT4、pMX-CMYC、pCDNA-LIF、pEGFPC1-SMAD2、pEGFPC1- SMAD3、pEGFPC1-SMAD7、人胚腎細胞(293T)、人宮頸癌細胞(Hela)、小鼠成肌細胞(C2C12) 和豬胎兒成纖維細胞(PEF) 由陜西省干細胞工程技術研究中心保存。載體pGEM-T Easy及熒光素酶檢測試劑盒Dual-Luciferase?Reporter Assay System均購自Promega公司。豬各組織器官采集于陜西萬盛肉類加工有限公司的屠宰場。

1.2 試劑及耗材

總RNA提取試劑盒、基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA marker均購自天根公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶、反轉錄試劑盒和聚合酶均購自Fermentas公司；高保真DNA聚合(PhantaTMHS Super-Fidelity DNA Polymerase) 購自Vazyme公司；定量PCR Mix (Power 2xSYBR Real-time PCR Premixture) 購自于Bioteke公司；脂質體 (Lipofectamine 2 000)、Opti-MEM和DMEM培養(yǎng)基均購自Invitrogen公司；非必需氨基酸 (NEAA)、L-谷氨酰胺 (L-Glu)、β-巰基乙醇 (β-ME) 購自Gibco公司；胎牛血清(FBS) 購自Hyclone公司；PCR 引物由華大基因科技服務有限公司合成。

1.3啟動子的克隆與載體構建

參照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒 (天根公司)，從PEF細胞中提取豬基因組DNA。從UCSC (http://genome.ucsc.edu/) 網(wǎng)站下載豬的5￠上游序列，設計帶有酶切位點d Ⅲ和Ⅰ的啟動子上下游引物，并擴增3.3 kb啟動子片段。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，并與pGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌DH5α中。挑取陽性克隆提取質粒，經(jīng)限制性內切酶Ⅰ、dⅢ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的質粒送華大生物工程有限公司測序。測序正確的質粒通過dⅢ和Ⅰ與pEGFP-1和pGL3-Basic連接，并分別命名為pE3.3和pL3.3。以pE3.3為模板，分別設計帶有酶切位點Ⅰ和dⅢ的上下游引物，擴增2 093 bp、1 503 bp、876 bp、575 bp和308 bp的啟動子片段，亞克隆到pGL3-Basic報告載體中，分別命名為pL2.0、pL1.5、pL0.8、pL0.5和pL0.3。引物序列見表1。

1.4 細胞培養(yǎng)與轉染

293T、Hela和C2C12細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。按照Lipofectine 2 000使用說明書，首先將pE3.3啟動子分別轉入293T、Hela和C2C12細胞，轉染后48 h在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。同時，將293T細胞按2.4×104/孔接種于48孔培養(yǎng)板中，待細胞完全貼壁覆蓋率至50%?60%時，將pL3.3、pL2.0、pL1.5、pL0.8、pL0.5和pL0.3等啟動子熒光報告載體 (500 ng) 和pCMV-Renilla表達載體 (20 ng) 共同轉入細胞，48 h后收集細胞并進行熒光素酶活性檢測。每個啟動子做3次獨立實驗，每次3個重復。

表1 引物序列表

1.5 熒光定量PCR

按照總RNA提取試劑盒說明書 (天根公司)提取組織總RNA，按照RevertAidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit相關說明進行反轉錄獲得cDNA，并設計qESRRB和qGAPDH引物。熒光定量PCR反應體系如下：2×SYBR Green Mix 10 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)，模板cDNA 1 μL，去離子水7 μL，共20 μL。每個樣本設3個重復。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。實時熒光定量PCR引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準偏差表示，并經(jīng)雙尾-test檢驗差異是否具有統(tǒng)計學意義。*表<0.05，**表示<0.01。

2 結果與分析

2.1 豬啟動子克隆及生物學分析

本研究從豬的基因組中克隆獲得了3 307 bp的基因5￠端上游片段(圖1A)。用生物信息學的方法發(fā)現(xiàn)序列上存在很多與多能性轉錄因子結合的位點，如：KLF4、MYC、SMAD和STAT3等(圖1B)。但是在轉錄起始位點上游缺乏經(jīng)典的TATA-box (TATAAA)。

圖1 ESRRB 3 kb啟動子克隆及生物信息學分析

2.2 多能性相關基因對調控分析

通過在線啟動子分析軟件JASPAR (http://jaspar.genereg.net/) 分析豬啟動子，發(fā)現(xiàn)KLF4 (–2 582，–1 488，–1 059，–860，–591，–123)；MYC (–1 759，–1 288)；STAT3 (–2 944，–2 067，–2 052，–1 316，–801)和SMAD(–2 723，–1 924，–1 414，–599) 等的可能結合位點。但是，未發(fā)現(xiàn)OCT4和SOX2的結合位點(圖2A)。通過將構建好的pL3.3分別與pMX-CMYC、pCDNA-LIF、pEGFPC1-SMAD2、pEGFPC1-SMAD3和pEGFPC1-SMAD2+ pEGFPC1-SMAD3共轉染293T細胞，發(fā)現(xiàn)這些因子都能一定程度地激活啟動子，其中SMAD2 + SMAD3的作用最為明顯，是只加入pL3.3的對照組的2.7倍(圖2B)。因為沒有SOX2的結合位點，pEGFP-SOX2并未提高的表達水平。

圖2 多能性基因對豬ESRRB啟動子的調控

2.3 豬組織特異性表達檢測

通過實時定量PCR對胸腺、脂肪、皮膚、肌肉、心臟、肝臟、腦、睪丸、卵巢、脾臟、腎臟和豬成纖維細胞中的表達情況進行了測定。結果顯示在腎臟表達最高，在與生殖相關的組織如睪丸卵巢中也有表達。而在脂肪、皮膚和肌肉等組織中的表達較低(圖3A)。這個結果與人和鼠的報道相似[13-14]。對攜帶3.3 kb啟動子片段的pE3.3進行d Ⅲ和Ⅰ酶切鑒定，結果表明插入片段正確(圖3B)。將pE3.3報告載體分別轉入C2C12、Hela和293T細胞，48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞表達GFP情況。結果顯示，在293T細胞中有GFP的表達，而在C2C12與Hela細胞中沒有GFP的表達(圖3C)。這一結果印證了啟動子在腎臟細胞中的高表達特性 (圖3A)。

圖3 定量檢測ESRRB的組織特異性表達

2.4 構建啟動子片段缺失載體

以重組質粒pE3.3為模板用不同的引物對啟動子5?端上游序列進行缺失，獲得 2 093 bp、1 503 bp、876 bp、575 bp和308 bp等片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析驗證，PCR擴增產(chǎn)物與預期片段大小相符(圖4A)。分別將這些片段插入到pGL3-basic質粒，構建pL2.0、pL1.5、pL0.8、pL0.5和pL0.3報告載體，并經(jīng)限制性內切酶d Ⅲ和Ⅰ雙酶切鑒定 (圖4B)。檢測結果表明酶切目的片段大小與預期吻合，載體構建正確。

2.5 篩選豬啟動子核心調控區(qū)

將攜帶不同啟動子片段的質粒pL3.3、pL2.0、pL1.5、pL0.8、pL0.5和pL0.3等，瞬時轉染293T細胞48 h后，對報告基因熒光素酶活性進行檢測。結果顯示，pL0.3沒有啟動子活性，而pL0.5的啟動子活性與對照組相比提高了約50倍。pL0.5相比于pL0.3多出了–269 bp至–25 bp之間的序列，表明該段序列存在一個正調控域是該啟動子的核心調控區(qū)域。進一步測定顯示pL0.8、pL1.5、pL2.0和pL3.3的活性比pL0.5的又提高了近70%，說明在啟動子–0.5至–0.8 bp之間的序列，還存在一個正調控域 (圖5)。這兩個調控域的調控元件和生物學功能還有待進一步探索研究。

圖4 ESRRB啟動子的PCR缺失及相應的熒光素酶報告載體構建

圖5 豬ESRRB不同長度啟動子的活性檢測

3 討論

雌激素家族相關受體基因β是維持ESCs自我更新的重要轉錄因子，抑制其表達會直接導致ESCs的分化[15]。研究發(fā)現(xiàn)Esrrb能夠與其他多能轉錄因子相互作用，在ESCs中與Oct4、Sox2、Nanog和Klf4擁有共同的結合位點[16]；同時，啟動子上存在Oct4、Nanog和Tcf3的結合位點[6]。本研究克隆了豬啟動子，經(jīng)生物信息學分析表明啟動子上存在潛在的、、和的結合位點。通過雙熒光素酶報告載體實驗發(fā)現(xiàn)，這些轉錄因子都能夠一定程度地激活豬啟動子活性。其中的效果最為顯著。所介導的信號通路Nodal/Activn能夠促進小鼠胚胎干細胞的增殖和自我更新[17]。該結果也表明通過與不同基因和通路的協(xié)同作用實現(xiàn)對自我更新的維持[18]。

通過實時定量PCR，我們發(fā)現(xiàn)主要在腎臟、脾臟、卵巢和睪丸中表達。將pE3.3分別轉入到人胚腎細胞293T、宮頸癌細胞Hela和小鼠成肌細胞C2C12中，表現(xiàn)出組織特異性表達，只在腎臟來源的293T中有綠色熒光表達。對比的組織表達譜研究表明，人的主要分布在腎臟和睪丸[19]；而小鼠的主要分布于腎臟和心臟[20]；大鼠的分布要廣泛一些，在腎臟、心臟、睪丸和神經(jīng)內分泌相關的組織中均檢測到表達[8]。通過比較豬、人、小鼠和大鼠的組織表達譜發(fā)現(xiàn)，在物種間表達有一定的差異，同時腎臟是表達的一個重要器官?？赡茉谄渲袇⑴c調節(jié)腎臟分泌固醇類激素[21]。

有報道通過對豬Ⅱ(UPII)[22]、[23]和[24]等基因的啟動子進行缺失發(fā)現(xiàn)了相應的核心啟動子。為了進一步分析啟動子的核心調控區(qū)域，我們對其3.3 kb啟動子進行了缺失。結果發(fā)現(xiàn)位于5?端上游–25 bp和–269 bp序列區(qū)有兩個轉錄調控域，能夠明顯調控啟動子活性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，不存在TATA box，是TATA-less基因。事實上TATA box作為典型的核心啟動子元件并非存在于所有的基因中。相反，大多數(shù)基因在轉錄的時候不需要TATA box[25]。

本文通過對豬組織特異表達的檢測和對啟動子核心調控區(qū)的測定，初步揭示了該基因的表達和調控特點，為進一步確定的調控機制及其對多能性的維持機理奠定了基礎。同時，構建的pE3.3報告載體也可以用于示蹤細胞重編程，為開展豬誘導多能干細胞的建系提供了新的手段。

REFERENCES

[1] Boyer LA, Lee TI, Cole MF, et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell, 2005, 122(6): 947–956.

[2] Ying QL, Wray J, Nichols J, et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature, 2008, 453(7194): 519–523.

[3] Doble BW, Woodgett JR. GSK-3: tricks of the trade for a multi-tasking kinase. J Cell Sci, 2003, 116(7): 1175–1186.

[4] Singh AM, Dalton S. The cell cycle and Myc intersect with mechanisms that regulate pluripotency and reprogramming. Cell Stem Cell, 2009, 5(2): 141–149.

[5] Guo G, Huang Y, Humphreys P, et al. A PiggyBac-based recessive screening method to identify pluripotency regulators. PLoS ONE, 2011, 6(4): e18189.

[6] Martello G, Sugimoto T, Diamanti E, et al. Esrrb is a pivotal target of the Gsk3/Tcf3 axis regulating embryonic stem cell self-renewal. Cell Stem cell, 2012, 11(4): 491–504.

[7] Festuccia N, Osorno R, Halbritter F, et al. Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells. Cell Stem cell, 2012, 11(4): 477–490.

[8] Giguère V, Yang N, Segui P, et al. Identification of a new class of steroid hormone receptors. Nature, 1988, 331(6151): 91–94.

[9] Heard DJ, Norby PL, Holloway J, et al. Human ERR gamma, a third member of the estrogen receptor-related receptor (ERR) subfamily of orphan nuclear receptors: tissue-specific isoforms are expressed during development and in the adult. Mol Endocrinol, 2000, 14(3): 382–392.

[10] Vanacker JM, Bonnelye E, Chopin-Delannoy S, et al. Transcriptional activities of the orphan nuclear receptor ERR alpha (estrogen receptor-related receptor-alpha). Mol Endocrinol, 1999, 13(5): 764–773.

[11] Mitsunaga K, Araki K, Mizusaki H, et al. Loss of PGC-specific expression of the orphan nuclear receptor ERR-beta results in reduction of germ cell number in mouse embryos. Mech Dev, 2004, 121(3): 237–246.

[12] Percharde M, Lavial F, Ng JH, et al. Ncoa3 functions as an essential Esrrb coactivator to sustain embryonic stem cell self-renewal and reprogramming. Genes Dev, 2012, 26(20): 2286–2298.

[13] Guiguen Y, Baroiller JF, Ricordel MJ, et al. Involvement of estrogens in the process of sex differentiation in two fish species: the rainbow trout () and a tilapia (). Mol Reprod Dev, 1999, 54(2): 154–162.

[14] Cheng G, Weihua Z, M?kinen S, et al. A role for the androgen receptor in follicular atresia of estrogen receptor beta knockout mouse ovary. Biol Reprod, 2002, 66(1): 77–84.

[15] Xie CQ, Jeong Y, Fu M, et al. Expression profiling of nuclear receptors in human and mouse embryonic stem cells. Mol Endocrinol, 2009, 23(5): 724–733.

[16] Chen X, Xu H, Yuan P, et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell, 2008, 133(6): 1106–1117.

[17] Ogawa K, Saito A, Matsui H, et al. Activin-Nodal signaling is involved in propagation of mouse embryonic stem cells. J Cell Sci, 2007, 120(Pt 1): 55–65.

[18] Papp B, Plath K. Pluripotency re-centered around Esrrb. EMBO J, 2012, 31(22): 4255–4257.

[19] Zhou W, Liu Z, Wu J, et al. Identification and characterization of two novel splicing isoforms of human estrogen-related receptor beta. J Clin Endocrinol Metab, 2006, 91(2): 569–579.

[20] Pettersson K1, Svensson K, Mattsson R, et al. Expression of a novel member of estrogen response element-binding nuclear receptors is restricted to the early stages of chorion formation during mouse embryogenesis. Mech Dev, 1996, 54(2): 211–223.

[21] Di Micco S, Renga B, Carino A, et al. Structural insights into estrogen related receptor-β modulation: 4-methylenesterols fromsponge as the first example of marine natural antagonists. Steroids, 2014, 80: 51–63

[22] Kwon DN, Park MR, Park JY, et al. Characterization of a putative cis-regulatory element that controls transcriptional activity of the pig uroplakin II gene promoter. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 410(2): 264–269.

[23] Zhao X, Mo D, Li A, et al. Characterization and transcriptional regulation analysis of the porcine PAQR6 gene. DNA Cell Biol, 2011, 30(11): 947–954.

[24] Tao H, Mei S, Zhang X, et al. Transcription factor C/EBP beta and 17beta-estradiol promote transcription of the porcine p53 gene. Int J Biochem Cell Biol, 2014, 47: 76–82.

[25] Goodrich JA, Tjian R. Unexpected roles for core promoter recognition factors in cell-type-specific transcription and gene regulation. Nat Rev Genet, 2010, 11(8): 549–558.

(本文責編郝麗芳)

Cloning and regulation of pig estrogen related receptor β gene () promoter

Fan Yang1, Yaxian Wang1, Lixia Du2, and Huayan Wang1

1 Shaanxi Center for Stem Cell Engineering and Technology, College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China 2 Innovation Experimental College, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China

The estrogen related receptor family member(Estrogen related receptor β) is a gene that expresses in the early stage of embryo and plays an important role in the core pluripotent network. Its function has been analyzed in human and mouse, although no report so far related to pig. Therefore, to explore its mechanism of transcriptional regulation and expression pattern, we cloned a 3.3 kb pigpromoter by PCR and constructed the green fluorescence protein (GFP) reporter vector pE3.3. We used these vectors to study theexpression pattern in 293T, Hela and C2C12. Sequence was analyzed for regulatory elements that share homology to known transcription factor binding sites by TFSEARCH and JASPER program. Some pluripotency related genes such as SMAD, STAT3, MYC, KLF4 and ESRRB have been found within the 3.3 kb sequence by co-transfected pigpromoter and these potential regulators. We found that ESRRB only expressed in 293T and SMAD could activateexpression obviously. To determine the core promoter region, a series ofpromoter fragments with gradually truncated 5?-end were produced by PCR and inserted into pGL3-Basic vector. After transient transfection into 293T, dual luciferase assay was used to measure these promoter activities. The result suggested that the core promoter of piglocated within ?25 bp to ?269 bp region. These results suggest that these transcription factor binding sites and the core promoter region may be essential for transcriptional regulation of piggene.

pig,, promoter, pluripotent cells, transcriptional regulation

July 14, 2014; Accepted:October 27, 2014

Huayan Wang. Tel: +86-29-87080069; E-mail: hhwang101@163.com

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31371505), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CBA01002).

國家自然科學基金(No. 31371505), 國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CBA01002) 資助。