王金丹，張光亞

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多酶共固定化的研究進(jìn)展

王金丹，張光亞

華僑大學(xué)生物工程與技術(shù)系，福建廈門(mén) 361021

王金丹, 張光亞. 多酶共固定化的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(4):469–480.Wang JD, Zhang GY. Progress in co-immobilization of multiple enzymes. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 469–480.

固定化酶技術(shù)是現(xiàn)代生物催化的核心技術(shù)。過(guò)去幾十年里，固定化酶技術(shù)的研究主要集中在單酶固定化。近年來(lái)，多酶共固定化由于具有可增加反應(yīng)的局部濃度、提高反應(yīng)收率等優(yōu)點(diǎn)而得到研究者的廣泛關(guān)注。本文根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究從多酶非特異性共價(jià)共固定化、非特異性非共價(jià)共固定化、非共價(jià)包埋固定化以及位點(diǎn)特異性固定化四個(gè)方面闡述多酶固定化方法的研究進(jìn)展，并分析和展望了其在工業(yè)上的應(yīng)用前景。

多酶共固定化，共價(jià)固定化，非共價(jià)固定化，包埋固定化, 特異性固定化

多酶固定化技術(shù)是指將多種酶同時(shí)固定在同一個(gè)載體中或?qū)⒍喾N酶通過(guò)交聯(lián)的方式形成共交聯(lián)酶聚集體的一種技術(shù)。眾所周知，在生物體或微生物細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑中，所有物質(zhì)代謝都由多酶共同作用來(lái)完成。如：三羧酸循環(huán)途徑 (Tricarboxylic acid cycle)，該過(guò)程需要丙酮酸脫氫酶、檸檬酸合成酶等9個(gè)酶的共同催化完成；此外，在生物體內(nèi)催化反應(yīng)過(guò)程中，酶可以形成復(fù)雜的多酶復(fù)合體 (Multi-enzyme complexes)，其催化的反應(yīng)高度有序，能極大提高酶催化效率[1-3]。正是由于多酶復(fù)合體這一優(yōu)點(diǎn)，促使研究者們?cè)隗w外人工制備多酶反應(yīng)體系，提高酶的催化效率，從而出現(xiàn)了多酶共反應(yīng)或多酶固定化等方式[4-5]。

生物反應(yīng)過(guò)程通常由多步連續(xù)反應(yīng)且需要多種酶的共同作用，解決此問(wèn)題的一個(gè)方法是多酶共反應(yīng)，即將多種酶置于同一反應(yīng)器中進(jìn)而得到目標(biāo)產(chǎn)物，與體內(nèi)代謝途徑相比，其復(fù)雜性大為降低[6]。Zou研究小組[7]通過(guò)3種酶共反應(yīng)以葡萄糖/半乳糖、ATP、UTP為底物成功合成尿苷二磷酸半乳糖 (UDP-Gal)、尿苷二磷酸葡萄糖 (UDP-Glc) 及其衍生物。多酶共反應(yīng)后酶的分離回收較困難，重復(fù)利用率低，穩(wěn)定性較差。另一種解決途徑是多酶共固定化，就是通過(guò)多點(diǎn)共價(jià)結(jié)合、共包埋、共吸附、特異性結(jié)合等方式固定化多酶。多酶共固定化可以提高酶的穩(wěn)定性，提高酶的重復(fù)利用率，增加反應(yīng)的局部濃度從而有利于提高產(chǎn)品的收率[2,8-9]。Singh等[10]以聚苯胺 (PANI) 薄膜為載體共價(jià)共固定化膽固醇酯酶 (ChEt) 和膽固醇氧化酶 (ChOx)，制備了膽固醇生物傳感器，可連續(xù)使用6周。但是，由于酶高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)酶活力影響較大，目前研究者們正致力于研究制備高度可控的固定化多酶，利用蛋白質(zhì)、RNA或DNA作為支架共定位固定化多酶，這種方法可以與酶特異性的結(jié)合，較好保持酶的空間構(gòu)象，減少酶活損失。此外，這種方法固定化的多酶，其酶與酶之間的距離較近，可減少傳質(zhì)阻力從而提高酶的催化效率[11-13]。例如，Niemeyer等[14]首次通過(guò)DNA雜交技術(shù)共固定化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 輔酶、黃素單核苷酸 (FMN) 氧化還原酶和熒光素酶，結(jié)果顯示其總酶活得到顯著提升。本文主要從多酶固定化的不同方式，即非特異性共價(jià)共固定化、非特異性非共價(jià)共固定化、非共價(jià)包埋固定化以及位點(diǎn)特異性固定化等4個(gè)方面介紹有關(guān)固定化多酶制備方法的最新研究進(jìn)展。

1 多酶的非特異性共價(jià)共固定化

1.1 有載體共價(jià)固定化

酶可以共價(jià)結(jié)合在不溶性的載體上形成固定化酶，其理論依據(jù)是蛋白質(zhì)表面具有豐富的功能基團(tuán)，能提供豐富的酶與載體的結(jié)合位點(diǎn)。最常見(jiàn)的共價(jià)結(jié)合是酰胺反應(yīng)。即：蛋白質(zhì)上的氨基如賴(lài)氨酸與載體上的羧基反應(yīng)，如碳化二亞胺可促進(jìn)反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵。在某些情況下，由于酶分子中賴(lài)氨酸的含量較大，通過(guò)這種方式固定化酶的活性會(huì)受到顯著影響。這時(shí)可選用蛋白質(zhì)表面上的其他反應(yīng)基團(tuán)，如半胱氨酸，它可通過(guò)形成二硫鍵固定化酶。這種制備方法能顯著提高共固定化多酶的穩(wěn) 定性[15-16]。

Torabi等[17]將膽固醇氧化酶 (COD) 和辣根過(guò)氧化物酶 (POD) 共價(jià)共固定化于珍珠巖表面。研究結(jié)果表明，固定化雙酶pH值穩(wěn)定性高于游離酶，最適pH值降低；固定化膽固醇氧化酶的熱穩(wěn)定性相比于游離酶提高了2倍，但固定化辣根過(guò)氧化物酶的熱穩(wěn)定性比游離酶低；共固定化多酶在重復(fù)使用20次以后其酶活回收率為65%，這表明固定化酶具有良好的重復(fù)利用率。盡管固定化多酶的穩(wěn)定性有較大提高，但其活性有不同程度的降低，分別為游離酶的50%和11%。

1.2 無(wú)載體共價(jià)固定化

有載體的共價(jià)固定化最大的缺點(diǎn)是：會(huì)引入大量的非催化基團(tuán)，同時(shí)載體的價(jià)格也較昂貴。為了克服這一缺點(diǎn)，衍生出一種新的方法來(lái)固定化多酶，即無(wú)載體交聯(lián)固定化酶[18]。交聯(lián)酶晶體 (CLECs) 和交聯(lián)酶聚集體 (CLEAs) 已成功應(yīng)用于單酶固定化，這種方法也可應(yīng)用于多酶固定化，這種固定化多酶稱(chēng)為共交聯(lián)酶聚合體 (Combi-CLEAs)。

Taboada-Puig等[19]以戊二醛作為交聯(lián)劑共聚集多功能過(guò)氧化物酶 (VP) 和葡萄糖氧化酶 (GOX)，得到共交聯(lián)酶聚合體。葡萄糖氧化酶可持續(xù)制備過(guò)氧化氫 (H2O2)，多功能過(guò)氧化物酶可以消除副產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)的影響。Talekar等[20]制備了三功能酶聚合體。他們將α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和支鏈淀粉酶用戊二醛交聯(lián)形成共交聯(lián)酶聚合物 (圖1)，掃描電鏡分析結(jié)果顯示聚合物為球形結(jié)構(gòu)。將交聯(lián)酶聚集體與游離酶直接混合反應(yīng)比較，其酶活回收率分別為100%、60%和40%，相比游離酶有所降低，但酶的熱穩(wěn)定性得到提高。此外，固定化多酶在重復(fù)利用5次后，性能未發(fā)生明顯變化。

2 多酶的非特異性非共價(jià)共固定

通過(guò)共價(jià)結(jié)合的固定化多酶，在某些情況下，由于制備條件較為劇烈，導(dǎo)致酶活回收率較低。這時(shí)，可選擇物理吸附的方式固定化多酶。物理吸附可通過(guò)疏水作用、離子相互作用、靜電作用等方式固定化酶。這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，不易引起酶失活或變性，具有可逆性，載體可重復(fù)利用[21-22]。

圖1 α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶三酶共交聯(lián)酶聚合物制備流程圖[20]

李桂江等[23]用蒙脫石作為載體，通過(guò)吸附共固定化糖化酶和α-淀粉酶，固定化雙酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，最適反應(yīng)pH為5.5，且具有良好的穩(wěn)定性。Pescador等[24]將葡萄糖氧化酶 (GOX) 和辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 共固定化于二氧化硅微粒表面的聚電解質(zhì)層，通過(guò)靜電作用將酶吸附于載體表面 (圖2)，其結(jié)果顯示，將兩種酶固定于同一靜電層其總體酶活高于將酶固定于不同的靜電層和游離酶。

3 多酶的非共價(jià)包埋共固定化

為了盡可能提高酶活回收率，并保持酶分子結(jié)構(gòu)的完整性，此時(shí)可選擇包埋法固定化酶。根據(jù)不同的包埋方法，包埋酶可以制備成珠狀、纖維狀、薄膜狀等。由于包埋過(guò)程不涉及酶的修飾，不需要酶的氨基酸殘基參與反應(yīng)，因而基本不改變酶的活性中心及高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活損失較少。但其缺點(diǎn)是：酶包埋在載體中，由于擴(kuò)散限制從而影響酶的催化效率。此方法比較適用于以小分子物質(zhì)作為底物的酶，底物容易擴(kuò)散進(jìn)入固定化酶的活性部位。目前，研究者正致力于研究多酶共包埋的方法來(lái)提高酶聯(lián)反應(yīng)的催化效率。常用的包埋材料有硅溶膠-凝膠、反膠束、脂質(zhì)體、病毒粒子等[2,25-26]。

圖2 共固定化GOX和HRP二氧化硅粒子示意圖[24]

孫玉英等[27]用海藻酸鈉包埋共固定化殼聚糖酶和β-D-氨基葡萄糖苷酶，固定化多酶的酶活回收率和相對(duì)活力分別為54%和38.5%，其酶活力相比于游離酶有所下降，但其酶的熱穩(wěn)定性相比于游離酶有所提高。Betancor等[28]將硝基苯硝基還原酶與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶共包埋于二氧化硅粒子中，實(shí)現(xiàn)連續(xù)催化硝基苯生成苯基羥胺，并伴隨NADPH輔酶的再生。Patterson等[29]將半乳糖激酶 (GALK)、葡萄糖激酶 (GLUK) 以及β-葡糖苷酶 (CelB) 共包埋于P22類(lèi)病毒顆粒 (VLP)，其原理如圖3所示。三種酶通過(guò)基因融合的方式與T7外套蛋白和支架蛋白共表達(dá)，再共包埋于類(lèi)病毒顆粒上。其酶活與單酶包埋于病毒顆粒相比無(wú)明顯差別，同時(shí)研究顯示耦合酶的活性依賴(lài)于精確的動(dòng)力學(xué)平衡關(guān)系，因而在設(shè)計(jì)方案的時(shí)候需結(jié)合酶的特性。

4 多酶的位點(diǎn)特異性共固定化

上述方法都在一定程度上使酶分子之間的距離縮短，但其只能有限地控制酶分子結(jié)構(gòu)與空間取向。共價(jià)結(jié)合以及吸附通常需要與酶分子的基團(tuán)相互作用，反應(yīng)是非特異性的，因而會(huì)影響酶的活性[30]。雖然包埋固定化酶沒(méi)有影響酶分子的結(jié)構(gòu)，但酶分子之間的相對(duì)距離仍然較遠(yuǎn)，且由于擴(kuò)散效應(yīng)影響酶的催化效 率[16,31]。因此，為了更好地提高酶催化效率，酶分子與載體的結(jié)合需要定向，以防止酶活性中心的氨基酸殘基與載體反應(yīng)結(jié)合進(jìn)而影響酶活，多種酶之間的相對(duì)位置需要精確控制，以便于更高效地催化反應(yīng)[2]。因此，衍生出特異性固定化酶的制備方法，出現(xiàn)了許多不同的特異性結(jié)合標(biāo)簽，如聚組氨酸、蛋白質(zhì)和DNA等。

圖3 P22固定化三酶制備流程圖[29]

4.1 組氨酸作為標(biāo)簽

適當(dāng)?shù)挠H和標(biāo)簽可以特異性地結(jié)合酶蛋白分子。最常用的親和標(biāo)簽是組氨酸標(biāo)簽，酶與鎳可通過(guò)組氨酸標(biāo)簽特異性的結(jié)合。組氨酸標(biāo)簽一般為6個(gè)組氨酸，通常位于蛋白質(zhì)的N端或C端，其對(duì)蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有影響[32]。Liu等[33]將這一技術(shù)用于生物合成半乳糖，這一過(guò)程包含7個(gè)酶，每種酶單獨(dú)表達(dá)并固定化于鎳瓊脂糖珠，研究結(jié)果顯示固定化酶催化效率高于游離酶。

4.2 纖維素結(jié)合區(qū)域 (Cellulose binding domain，CBD) 作為標(biāo)簽

許多厭氧纖維素分解菌可產(chǎn)生被稱(chēng)為纖維小體的細(xì)胞外大分子復(fù)合物。在纖維小體中，多種纖維素酶共固定于支架蛋白上，支架蛋白包括粘連模塊 (Cohesins) 和對(duì)接模塊 (Dockerin)，支架蛋白可通過(guò)CBD特異性結(jié)合纖維素固定于纖維素上[34]。根據(jù)這一原理，可以在體外人工構(gòu)建纖維小體固定化纖維素酶。

Mitsuzawa等[35]構(gòu)建了包含4種不同纖維素酶的纖維小體，稱(chēng)為羅塞塔小體 (Rosettasome)，具有耐熱性，其結(jié)構(gòu)如圖4所示，圖中顯示了兩種不同結(jié)構(gòu)的羅塞塔小體，研究顯示相比于游離酶，纖維小體中總酶活有一定程度的 提高。

圖4 兩種不同結(jié)構(gòu)的羅塞塔小體結(jié)構(gòu)示意圖(紅色：粘連模塊；藍(lán)色：纖維素酶；綠色：對(duì)接模塊；灰色：蛋白質(zhì)支架)[35]

4.3 DNA作為支架固定化多酶

大量研究表明，多酶體系中酶的空間排列以及方向在酶的催化反應(yīng)中直接影響酶的活性。天然的多酶復(fù)合體是酶與酶之間通過(guò)亞基或者多肽形成復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)或四級(jí)結(jié)構(gòu)，使酶分子的催化中心彼此靠近。與游離酶相比，多酶復(fù)合體中反應(yīng)的中間產(chǎn)物可以迅速轉(zhuǎn)移從而減少擴(kuò)散損失，提高了中間產(chǎn)物的局部濃度，因而提高了酶的催化效率[36]。相比于其他固定化方法，以DNA作為支架的固定化酶可精確控制酶分子的空間排列以及方向，降低傳質(zhì)阻力從而提高酶的催化效率，因而引起了研究者的廣泛關(guān)注。多酶之間的相對(duì)位置可以由不同標(biāo)記的DNA和不同序列長(zhǎng)度的DNA進(jìn)行調(diào)控。利用DNA雜交技術(shù)制備固定化多酶的關(guān)鍵是：兩條互補(bǔ)的單鏈DNA (ssDNA) 分子如何在溫和條件下成功配對(duì)，形成螺旋結(jié)構(gòu)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可提高酶穩(wěn)定性以及最大可能地保持酶活性[37]。目前，DNA折紙術(shù) (DNA origami) 作為一種新型的DNA自組裝方法在固定化多酶中顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性，通過(guò)將一條長(zhǎng)的DNA單鏈 (通常為基因組DNA) 與一系列經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的短DNA片段進(jìn)行堿基互補(bǔ)，能夠可控地構(gòu)造出高度復(fù)雜的納米圖案或結(jié)構(gòu)，以有效控制酶分子間的距離[38]。

Yan[39]和Fan[40]兩個(gè)研究小組均以葡萄糖氧化酶 (GOX) 和辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)作為固定化的模型酶，分別利用DNA折紙納米粒子以及DNA納米管制備了固定化多酶。研究表明，當(dāng)酶分子之間的距離為10 nm時(shí)，級(jí)聯(lián)反應(yīng)中酶的整體活性可超出游離酶的15倍。Wilner等[41]利用同樣的方法固定了這兩種酶，設(shè)計(jì)了兩種不用六角形的DNA支架，結(jié)構(gòu)如圖5所示，結(jié)果表明：相比于游離酶直接混合的反應(yīng)器，固定化后的多酶能更有效地催化反應(yīng)。

4.4 其他特異性結(jié)合標(biāo)簽

類(lèi)彈性蛋白 (Elastin-like polypeptides, ELPs)、刀豆秋蛋白A、抗生物素蛋白等都可以作為特異性結(jié)合標(biāo)簽固定化多酶。ELPs作為非色譜純化標(biāo)簽在蛋白質(zhì)分離純化中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本課題組[42]利用ELPs相變的特性，以ELPs 相變聚集成的顆粒作為固定化酶進(jìn)行分離純化，酶的分離純化與固定化可以同步進(jìn)行，該方法純化后木聚糖酶的回收率約為21.2%，純化倍數(shù)約為3.2。刀豆秋蛋白A可與糖基化酶特異性結(jié)合；抗生物素蛋白可與生物素化的酶特異性結(jié)合，這些結(jié)合標(biāo)簽都可以開(kāi)發(fā)制備固定化多酶。Yu等[43]將唾液酸轉(zhuǎn)移酶固定化于生物素標(biāo)記的功能化磁性納米顆粒上，該固定化酶在重復(fù)利用10次后酶活回收率約為50%。

圖5 雙-六角形和四-六角形DNA支架共固定化GOX和HRP結(jié)構(gòu)示意圖[41]

本課題組設(shè)計(jì)了一種新型類(lèi)彈性蛋白多肽ELPs，在一定條件下，ELPs可同木聚糖酶一起自組裝形成不溶性納米顆粒，經(jīng)分離后仍具催化能力，其對(duì)底物的親和性略劣于游離酶，但其穩(wěn)定性有顯著提高[44]。目前，我們正嘗試將其作為標(biāo)簽固定化木聚糖酶和地衣多糖酶。ELPs與酶分子通過(guò)分子粘合劑 (SpyTag和SpyCatcher) 連接，SpyTag和SpyCatcher可以自發(fā)地形成異肽鍵，反應(yīng)可以在溫和的條件下進(jìn)行。ELPs在高溫下相變聚集為固定化多酶顆粒，顆粒通過(guò)可逆相變循環(huán) (Inverse transition cycling，ITC) 回收利用，只需離心等簡(jiǎn)單的操作步驟就可以實(shí)現(xiàn)酶的回收利用，這種固定化多酶方法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、固定化與分離純化可同步進(jìn)行等特點(diǎn)，是一種新型固定化多酶的方法。

5 固定化多酶的應(yīng)用

固定化多酶在生物傳感器、食品加工和生物醫(yī)學(xué)等方面都具有很大的應(yīng)用前景。如Doong等[45]用凝膠-溶膠法共固定化谷氨酸脫氫酶和乙酰膽堿酯酶及辣根過(guò)氧化物酶，利用固定化多酶制備了可同時(shí)監(jiān)測(cè)血液樣品中乙酰膽堿、谷氨酸鹽、H2O2和β-淀粉樣蛋白 (β-amyloid) 的生物傳感器，其可在臨床上作為阿茲海默癥診斷的依據(jù)。Yotova等[46]通過(guò)共價(jià)法共固定化乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶于納米膜上制備了光纖維生物傳感器，該傳感器可用于殺蟲(chóng)劑的檢測(cè)。Javier等[47]用瓊脂糖小球共固定化甲酸脫氫酶和NADH氧化酶及過(guò)氧化物酶，該多酶系統(tǒng)可將溶液中的酚類(lèi)物質(zhì)氧化為固體物質(zhì)同時(shí)實(shí)現(xiàn)輔因子的再生，可應(yīng)用于污水處理系統(tǒng)中。楊安樹(shù)等[48]用交聯(lián)法共固定化雙蛋白酶水解魚(yú)鱗膠原蛋白，利用該固定化多酶制備的抗氧化活性肽可以作為天然抗氧化劑添加到食品、藥品以及化妝品中。李鑫[49]將蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶固定化于可逆溶解性pH敏感的高分子載體上，同樣的方法制備固定化醇氧化酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶。該雙固定化多酶體系可以用來(lái)生產(chǎn)L-2-氨基丁酸，利用可逆溶解的特性可簡(jiǎn)單快速地分離固定化酶與產(chǎn)物，同時(shí)實(shí)現(xiàn)固定化酶的重復(fù)利用，該方法生產(chǎn)的L-2-氨基丁酸的光學(xué)純度高于98%，反應(yīng)物轉(zhuǎn)化率大于96%。目前，基于葡萄糖異構(gòu)酶的共固定化多酶已實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)，該類(lèi)固定化多酶可以直接利用淀粉或者纖維素生產(chǎn)果糖漿[50]。

6 總結(jié)與展望

酶作為高效的生物催化劑廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究以及工業(yè)生產(chǎn)上。生物體內(nèi)廣泛存在的多酶復(fù)合體極大提高了酶的催化效率，促使研究者們?cè)隗w外制備固定化多酶以提高酶穩(wěn)定性及催化效率。在過(guò)去幾十年里，研究者們已經(jīng)發(fā)展了多種固定化多酶的方法，拓展了其應(yīng)用領(lǐng)域，固定化多酶在輔酶回收、生物傳感器、生物芯片等領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景。上述多酶固定化方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，需要根據(jù)酶的特性選擇合適的固定化方法。表1列舉了一些已報(bào)道的固定化多酶體系，大部分是以GOX-HRP為模型酶，可為選擇合適的多酶固定化方法提供參考。

另外，在選擇固定化酶方法的時(shí)候，可同時(shí)結(jié)合多種方法共固定化多酶，如van Dongen等[62]同時(shí)使用共價(jià)結(jié)合、包埋及疏水作用共固定化多酶，其制備流程如圖6所示，該多酶以雙親分子PS-PIAT嵌段共聚物為載體，葡萄糖氧化酶 (GOX) 包埋于微囊內(nèi)，脂肪酶 (LPS) 利用疏水作用固定于微囊壁中，通過(guò)疊氮反應(yīng)將辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 接于微囊表面。這種分隔式固定化多酶可有效提高酶催化效率，提高底物傳遞效率。

表1 最近報(bào)道的共固定化多酶例子

圖6 高分子微囊中分隔式固定多酶(GOX, LPS, HRP)[62]

總之，為了達(dá)到更好固定化多酶催化效果，在多酶固定化時(shí)需充分考慮以下幾個(gè)因素：1) 共固定化過(guò)程中，需要充分考慮每個(gè)酶的結(jié)構(gòu)和功能；2) 根據(jù)酶的特性選擇合適的連接方式以及載體；3) 多酶固定化時(shí)，可根據(jù)單酶固定化的結(jié)果優(yōu)化固定化條件，以獲得更高酶活的固定化多酶。在過(guò)去的幾十年里，可控的多酶固定化方法不斷涌現(xiàn)，一方面，為減弱多酶混合時(shí)酶分子間的相互抑制作用，可根據(jù)不同的作用方式將酶固定于多尺寸載體的不同層面，制備分隔式固定化多酶，以有效控制酶的相對(duì)位置；另一方面，以DNA、蛋白質(zhì)為支架的可控多酶固定化方法極大縮短了酶分子間的距離，能有效減少中間產(chǎn)物的傳遞距離，受到研究者的廣泛關(guān)注。隨著多酶共固定化技術(shù)的不斷發(fā)展，相信制備的固定化多酶將會(huì)越來(lái)越接近于天然的多酶復(fù)合體，并具有更強(qiáng)的催化效率。可重復(fù)利用和連續(xù)催化反應(yīng)的固定化多酶必將會(huì)成為新一代生物催化劑，廣泛應(yīng)用于生物工程各領(lǐng)域。

目前，共固定化多酶在工業(yè)上的應(yīng)用還很少，其原因是共固定化多酶成本較高。目前，固定化多酶的研究仍主要集中于共固定化方法的改進(jìn)與開(kāi)發(fā)，以獲得高催化效率、低成本的固定化多酶。相信隨著研究的不斷深入，固定化多酶將會(huì)工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮巨大的作用。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Progress in co-immobilization of multiple enzymes

Jindan Wang, and Guangya Zhang

Department of Bioengineering and Biotechnology, Huaqiao University,Xiamen361021, Fujian, China

Enzyme immobilization is the core technology of biocatalysis. Over the past few decades, enzyme immobilization research mainly focused on single enzyme immobilization. In recent years, multi-enzyme immobilization attracts more and more attention as it could increase the local concentration of reaction and improve the reaction yield. In this review, a summary of the recent progress, together with our research, is presented. Special emphasis is placed on four methodsin multi-enzymes co-immobilization, namely, the nonspecific covalent co-immobilization, the nonspecific non-covalent co-immobilization, the non-covalent encapsulation co-immobilized and the site specificity co-immobilized. Finally, some industrial uses of immobilized multi-enzymes were addressed and the application prospect of multi-enzyme immobilization was highlighted.

multi-enzymes co-immobilization,covalent immobilization, non-covalent immobilization, embedding immobilization, specific immobilization

June 25, 2014; Accepted: October 28, 2014

Guangya Zhang. Tel: +86-592-6162302; E-mail: zhgyghh@hqu.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21376103), Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2013J01048).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 21376103)，福建省自然科學(xué)基金 (No. 2013J01048) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-11-18

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140346.html