郭磊，孔建強(qiáng)

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匹諾塞林合成生物學(xué)研究進(jìn)展

郭磊，孔建強(qiáng)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

郭磊, 孔建強(qiáng). 匹諾塞林合成生物學(xué)研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(4): 451–460.Guo L, Kong JQ. Progress in synthetic biology ofpinocembrin. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 451–460.

匹諾塞林是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，具有很好的生物活性，如神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗氧化等。2009年，匹諾塞林被CFDA批準(zhǔn)為Ⅰ類注射新藥，主要用于治療急性腦卒中，現(xiàn)已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。匹諾塞林的良好成藥性使其合成方法備受關(guān)注。匹諾塞林可以通過化學(xué)合成、植物提取和合成生物學(xué)技術(shù)制備。合成生物學(xué)技術(shù)是一種環(huán)境友好的工程化生物技術(shù)，代表未來匹諾塞林的合成發(fā)展方向。文中總結(jié)了利用合成生物學(xué)技術(shù)制備匹諾塞林的研究現(xiàn)狀，并從選擇酶的物種來源、提高丙二酰CoA含量、選擇經(jīng)濟(jì)的底物及減弱中間產(chǎn)物的抑制作用等角度系統(tǒng)地總結(jié)了提高微生物合成匹諾塞林的策略。

匹諾塞林，黃酮類化合物，合成生物學(xué)，發(fā)酵策略

匹諾塞林(Pinocembrin) 屬于二氫黃酮，是黃酮類化合物生物合成途徑中重要的中間產(chǎn)物，經(jīng)過羥基化、烷基化、糖基化或氧化等反應(yīng)可生成其他黃酮。匹諾塞林最早發(fā)現(xiàn)于蜂膠，在蜂膠所含的黃酮類化合物中其含量最豐富[1]。由于具有一個(gè)手性中心，匹諾塞林存在一對(duì)光學(xué)異構(gòu)體，自然界中發(fā)現(xiàn)的均為構(gòu)型。

1 匹諾塞林生物活性

匹諾塞林具有良好的生物活性，如神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗氧化等，其中神經(jīng)保護(hù)方面活性使其具有極高的成藥性，在2009年匹諾塞林被CFDA批準(zhǔn)為Ⅰ類注射新藥，主要適應(yīng)癥為急性腦卒中[2]。

1.1 神經(jīng)保護(hù)

匹諾塞林對(duì)急性腦缺血具有良好的保護(hù)作用，可以減小腦梗塞面積，保護(hù)腦線粒體結(jié)構(gòu)，減輕缺血再灌注后對(duì)血腦屏障的損傷及舒張血管。

在發(fā)生缺血再灌注時(shí)，因供氧不足會(huì)導(dǎo)致腦線粒體呼吸鏈損傷[3]。對(duì)于急性腦缺血模型[4-7]，匹諾塞林可以保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)，改善線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)程度，增強(qiáng)氧化磷酸化效率，促進(jìn)線粒體呼吸功能，提高線粒體ATP合成能力而發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用。在細(xì)胞水平，匹諾塞林能促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞中ATP的生成；在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)它能夠顯著增加急性腦缺血模型大鼠腦線粒體的ADP/O、V3及RCI、OPR等參數(shù)值，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)完整性。對(duì)于慢性腦缺血模型[8-9]，匹諾塞林可以改善大鼠認(rèn)知障礙，減少腦線粒體內(nèi)活性氧生成，提高線粒體膜膜電位，降低線粒體腫脹程度。此外，匹諾塞林對(duì)全腦缺血再灌注模型大鼠血腦屏障具有保護(hù)作用[10]。

研究還發(fā)現(xiàn)匹諾塞林對(duì)阿爾茨海默氏病相關(guān)缺陷神經(jīng)血管單元具有保護(hù)作用。Liu等[11]對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠連續(xù)給藥，發(fā)現(xiàn)匹諾塞林能夠保護(hù)神經(jīng)纖維超微架構(gòu)、減少活化的膠質(zhì)細(xì)胞、降低炎癥因子水平、改善膽堿能系統(tǒng)和RAGE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能、減輕纖維狀β1–42淀粉樣蛋白對(duì)神經(jīng)血管單元(NVU) 的損害等。另外，匹諾塞林還具有舒張血管作用[12]。

1.2 抗菌

匹諾塞林和許多黃酮類化合物均具有抗菌活性。Koo等[13]對(duì)蜂膠中的天然化合物進(jìn)行了抗菌活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明(2)-匹諾塞林抗菌活性最高。隨后科學(xué)家們采取平皿稀釋法、紙碟法和Denlay多點(diǎn)接種法等對(duì)匹諾塞林進(jìn)行了大量體內(nèi)外抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明匹諾塞林對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制能力要強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，同時(shí)對(duì)某些耐藥菌也有抑制作用[14-15]。

1.3 抗氧化

匹諾塞林抗氧化作用表現(xiàn)在能清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化和清除二價(jià)金屬陽(yáng)離子等。Santos等[16]在研究天然類黃酮對(duì)脂質(zhì)過氧化作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)匹諾塞林對(duì)其具有抑制作用，特別是ADP/Fe (Ⅱ)-誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化。Estevinho等[17]從蜂膠分離出酚類化合物，并研究了其生物活性，結(jié)果表明匹諾塞林可以減少DPPH自由基和降低Fe3+/鐵氰化合物的比值。

1.4 其他

匹諾塞林具有抗癌活性，能殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT116)，可能是通過依賴Bax蛋白的線粒體凋亡機(jī)制來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[18-19]。匹諾塞林還具有其他藥理活性，例如抗原蟲、抗誘變、抑制睪丸酮5-還原酶、抑制酪氨酸酶、抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、抑制肥大細(xì)胞及中性粒細(xì)胞分泌和局部麻醉等[16-17,20]。

2 匹諾塞林的生物合成

目前，匹諾塞林可以通過化學(xué)合成、植物提取以及合成生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行制備。匹諾塞林常采用查爾酮閉環(huán)合成法進(jìn)行化學(xué)合成[14]，雖然該方法可以快速得到產(chǎn)物，但需要使用大量有毒化學(xué)試劑，反應(yīng)條件較苛刻，能源消耗大且該方法的產(chǎn)物是消旋體，然而只有構(gòu)型產(chǎn)物具有生物活性。匹諾塞林廣泛存在于植物中，Rasul等[21]歸納了匹諾塞林在植物界和在植物組織中的分布。盡管匹諾塞林在植物中廣泛分布，但含量低、植物組織中物質(zhì)成分復(fù)雜和分離純化困難等一系列問題大大限制植物提取方法的應(yīng)用。此外，植物資源的保護(hù)也是必須考慮的因素。

相比于化學(xué)合成和植物提取，生物合成方法具有原料價(jià)廉、反應(yīng)要求較低、能耗低和環(huán)境友好等特點(diǎn)，具有很好的發(fā)展前景。此外，匹諾塞林生物合成途徑較短，利用微生物合成相對(duì)容易。

匹諾塞林生物合成途徑的解析及關(guān)鍵酶的研究是應(yīng)用合成生物學(xué)技術(shù)制備該化合物的基礎(chǔ)?，F(xiàn)已知黃酮類化合物的生物合成主要經(jīng)由莽草酸途徑和多酮化途徑。如圖1所示，莽草酸途徑來源的苯丙氨酸和酪氨酸作為前體物質(zhì)，分別經(jīng)苯丙氨酸裂解酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL) 和酪氨酸裂解酶(Tyrosine ammonia lyase，TAL) 裂解后生成肉桂酸和對(duì)香豆酸[22]。肉桂酸也可以在肉桂酸4-羥化酶(Cinnamate 4-hydroxylase，C4H) 作用下形成對(duì)香豆酸[23]。對(duì)香豆酸輔酶A連接酶(4-Coumaroyl CoA ligase，4CL) 可同時(shí)催化肉桂酸和對(duì)香豆酸在其羰基上連接CoA分別生成肉桂酰CoA和對(duì)香豆酰CoA，二者在查爾酮合酶(Chalcone synthase，CHS) 催化下與丙二酰CoA縮合環(huán)化分別生成匹諾塞林查爾酮(Pinocembrin chalcone) 和柚皮素查爾酮(Naringenin chalcone)，隨后經(jīng)查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase，CHI) 作用生成構(gòu)型的匹諾塞林((2)-Pinocembrin) 和柚皮素((2)-Naringenin)。二者作為黃酮代謝中間產(chǎn)物可以生成其他類黃酮，例如異黃酮合成酶(Isoflavone synthase，IFS) 將其催化為異黃酮，黃酮合成酶(Flavone synthase，F(xiàn)NS) 可以催化其生成黃酮，黃烷酮3-羥化酶(Flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H) 和黃酮醇合成酶(Flavonol synthase，F(xiàn)LS) 聯(lián)合作用下生成黃酮醇等。

構(gòu)建匹諾塞林工程菌是應(yīng)用合成生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)的首要問題。匹諾塞林的代謝途徑如圖1所示，運(yùn)用基因工程的方法將不同物種來源的關(guān)鍵酶基因，如、、和等，按照最適優(yōu)化的原則構(gòu)建成不同模塊，然后導(dǎo)入底盤細(xì)胞，在這些宿主中重構(gòu)一條匹諾塞林的生物合成途徑，通過這些構(gòu)建的工程菌，制備匹諾塞林。高效的合成途徑往往不僅受限于單一的限速酶促反應(yīng)，而是需要多個(gè)酶促反應(yīng)之間的相互協(xié)調(diào)。利用代謝工程手段對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)節(jié)，使代謝流最大程度流向匹諾塞林[24]。最后，從生理性能和生產(chǎn)環(huán)境適應(yīng)能力方面對(duì)工程菌進(jìn)行優(yōu)化，使之成為實(shí)際生產(chǎn)可用的高產(chǎn)菌株[25]。

圖1 黃酮類化合物生物合成途徑

3 提高匹諾塞林生物合成的策略

隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，利用微生物進(jìn)行異源合成黃酮類化合物成為研究熱點(diǎn)，自2003年起人們對(duì)利用微生物異源合成黃酮類化合物表現(xiàn)出極大的興趣[26]。雖然生物合成法具有很大優(yōu)勢(shì)，但產(chǎn)量低這一難題嚴(yán)重阻礙了該法在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用?？蒲腥藛T進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)，采取了多種方法讓代謝流最大程度流向黃酮類化合物。本文將從以下幾點(diǎn)來闡述提高微生物合成匹諾塞林的策略。

3.1 選擇高活性的酶

來自同一家族的酶，由于物種來源不同其催化活性往往不同，在構(gòu)建工程菌時(shí)一般選擇酶活性高的物種[27-29]。Lonard等[30]以大腸桿菌為底盤細(xì)胞，構(gòu)建工程菌E1，選取矮牽牛來源的，同時(shí)構(gòu)建菌株E2，其來源于紫花苜蓿，經(jīng)發(fā)酵發(fā)現(xiàn)菌株E2的匹諾塞林產(chǎn)量遠(yuǎn)高于菌株E1，緊接著將紫花苜蓿的CHI活性和其他物種來源的CHI活性進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)仍是前者活性高。Park等[31]發(fā)現(xiàn)擬南芥的CHS活性高于矮牽牛的CHS，前者匹諾塞林的產(chǎn)量為6.0 mg/L，后者的產(chǎn)量卻小于0.1 mg/L。

此外，由于密碼子偏愛性會(huì)對(duì)蛋白異源性表達(dá)產(chǎn)生影響，從而降低其催化能力。為了提高異源蛋白表達(dá)水平，在選定酶物種來源后，常采取密碼子優(yōu)化的方法來解決異源性表達(dá)降低所帶來酶活性降低這一問題[32]。Santos等[33]利用類球紅細(xì)菌的、擬南芥、鏈霉菌的和葛根的構(gòu)建了工程菌，表達(dá)后發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)量不高。對(duì)上述4種蛋白表達(dá)所需密碼子進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)在參與翻譯RgTAL的密碼子中有41個(gè)是稀有密碼子，AtCHS為33個(gè)，Sc4CL為32個(gè)。緊接著對(duì)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的RgTALsyn催化生成對(duì)香豆酸的產(chǎn)量為104 mg/L，而未優(yōu)化組產(chǎn)量?jī)H為5.5 mg/L。

3.2 提高丙二酰CoA的含量

利用微生物合成黃酮化合物面臨諸多挑戰(zhàn)，底盤細(xì)胞內(nèi)前體物質(zhì)的供給就是其中之一，如丙二酰CoA的供給。三分子丙二酰CoA和一分子的肉桂酰CoA在CHS催化下生成匹諾塞林查爾酮，該步是微生物合成黃酮類化合物的關(guān)鍵步驟[34]。丙二酰CoA代謝途徑如圖2所示：1) 由葡萄糖代謝產(chǎn)生的乙酰CoA在乙酰CoA羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC) 作用下生成丙二酰CoA；2) 丙二酸鹽在丙二酸鹽載體蛋白(Malonate carrier protein，MatC) 作用下進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)丙二酰CoA合酶(Malonyl-CoA synthase，MatB) 催化生成丙二酰CoA；3) 丙二酰CoA降解途徑，除了參與黃酮類化合物合成外，還可以以丙二酰-ACP為中間體形式參與TAC循環(huán)。研究表明微生物胞內(nèi)丙二酰CoA含量非常低且無法外源性添加，Takamura 等[35]研究表明在以葡萄糖為碳源時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的乙酰CoA的含量為200–600 μmol/L，而丙二酰CoA含量?jī)H為4–90 μmol/L。圍繞如何提高細(xì)胞內(nèi)丙二酰CoA含量而采取的策略可歸納為對(duì)丙二酰CoA代謝的開源節(jié)流。

3.2.1 開源1——調(diào)控糖代謝途徑

乙酰CoA經(jīng)ACC催化直接生成丙二酰基CoA，首先選取該酶作為調(diào)控目標(biāo)。ACC含有4個(gè)亞單位，分別由、、和編碼。Leonard等[30]選擇革蘭氏陰性菌發(fā)光桿菌來源的和，將二者構(gòu)建在一個(gè)質(zhì)粒 (由一個(gè)T7啟動(dòng)子控制)上，和構(gòu)建在另一質(zhì)粒 (由獨(dú)立的T7啟動(dòng)子控制) 上，兩質(zhì)粒與歐洲芹、和紫花苜蓿來源共轉(zhuǎn)表達(dá)后匹諾塞林的產(chǎn)量可以達(dá)到196 mg/L。ACC是一種生物素依賴的羧化酶，其功能的發(fā)揮需要生物素作為輔助因子，由ACC-生物素連接酶(BPL，編碼) 介導(dǎo)二者相互連接。為了提高ACC的催化效率，研究人員通過構(gòu)建含有的質(zhì)粒來上調(diào)BPL的表達(dá)。通過共表達(dá)ACC、BPL和上述3種酶，匹諾塞林產(chǎn)量可以高達(dá)367 mg/L。

圖2 丙二酰CoA生物合成途徑

提高乙酰CoA的含量可以增加胞內(nèi)丙二酰CoA的含量，故抑制乙酰CoA代謝可以達(dá)到開源的效果。生成乙酸是乙酰CoA代謝去路之一，另外在發(fā)酵過程中乙酸還會(huì)對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制[36]，故對(duì)乙酸生成途徑進(jìn)行抑制具有一舉兩得之效。乙酰CoA與乙酸之間相互轉(zhuǎn)化有兩種途徑，如圖2所示：1) 磷酸轉(zhuǎn)乙酰基酶催化乙酰CoA生成Acetyl-P，再經(jīng)乙酸激酶催化生成乙酸；2) 乙酸可以由乙酰CoA合成酶催化生成乙酰CoA。質(zhì)粒pCOLADuet-ackA-pta和質(zhì)粒pCOLADuet-acs分別與由、、和構(gòu)成的上游模塊共轉(zhuǎn)后進(jìn)行發(fā)酵，檢測(cè)乙酸和匹諾塞林的含量，實(shí)驗(yàn)表明AckA-Pta途徑所產(chǎn)生的乙酸比Acs途徑高，其原因可能是前者為可逆途徑。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中添加2 g/L乙酸，上述菌株的匹諾塞林產(chǎn)量可高達(dá)429 mg/L[30]。

3.2.2 開源2——提高M(jìn)atC和MatB的表達(dá)

如圖2所示，細(xì)胞外的丙二酸鹽由MatC進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，進(jìn)入細(xì)胞后在MatB催化下生成丙二酰基CoA[37]。將由、和構(gòu)建的上游代謝模塊與由和構(gòu)成的丙二酰CoA合成模塊進(jìn)行適配性組裝，在含有2 g/L丙二酸鹽的M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)，與僅有上游代謝模塊的工程菌相比，匹諾塞林產(chǎn)量從29 mg/L升高到480 mg/L，增加了14.6倍[38]。

3.2.3 節(jié)流——抑制脂肪酸代謝

丙二酰CoA除了參與黃酮生物合成還可以在FabD、FabB和FabF等酶作用下生成acyl-ACP參與TAC循環(huán)。淺藍(lán)菌素(Cerulenin) 可以抑制FabB和FabF，將含有匹諾塞林基礎(chǔ)代謝途徑菌株E2在M9培養(yǎng)基上培養(yǎng)，雖然添加淺藍(lán)菌素后生物量會(huì)降低，但匹諾塞林產(chǎn)量會(huì)大大提高，高達(dá)710 mg/L，這是目前利用微生物合成匹諾塞林所有文獻(xiàn)中產(chǎn)量最高的報(bào)道[38]。令人遺憾的是淺藍(lán)菌素價(jià)格昂貴大大限制了這一方法的應(yīng)用。

3.3 選擇經(jīng)濟(jì)的底物

通過合成生物學(xué)技術(shù)合成匹諾塞林時(shí)，底物的選擇取決于代謝途徑中相關(guān)酶種類的選擇。底物的價(jià)格是實(shí)際生產(chǎn)中必須考慮的一個(gè)因素。Santos等[33]構(gòu)建了一條經(jīng)濟(jì)的合成途徑，無需直接添加前體氨基酸，而是使用更為廉價(jià)的葡萄糖作為碳源就可直接合成黃酮類物質(zhì)。首先在大腸桿菌中構(gòu)建酪氨酸代謝途徑，使其能夠產(chǎn)生較高濃度的酪氨酸，然后以此為底盤細(xì)胞并嵌入密碼子優(yōu)化的、、和構(gòu)建黃酮合成模塊。Wu等[39]構(gòu)建4個(gè)質(zhì)粒模塊，模塊1包含糖代謝相關(guān)基因3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶基因和預(yù)苯酸脫水酶基因，模塊2包含將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酰CoA的和，模塊3包含將肉桂酰CoA轉(zhuǎn)化為匹諾塞林的和，模塊4含有將丙二酸鹽催化為丙二酰基CoA的和。工程菌只需在僅有葡萄糖的MOPS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用一步發(fā)酵法就可以達(dá)到生物量和匹諾塞林產(chǎn)量均很高的效果。

3.4 減弱中間產(chǎn)物的抑制作用

一條代謝通路往往由多個(gè)酶構(gòu)成，中間產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)上游酶活性產(chǎn)生抑制。中間產(chǎn)物含量往往與相關(guān)的酶表達(dá)水平直接相關(guān)，故通過調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)水平以降低中間產(chǎn)物含量，進(jìn)而削弱抑制作用。蛋白的表達(dá)水平可以由表達(dá)載體拷貝數(shù)和啟動(dòng)子強(qiáng)度綜合決定，即由二者的乘積來量化[40]。質(zhì)粒pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1和pRSFDuet-1的拷貝數(shù)分別是10、20、40和100，T7啟動(dòng)子的強(qiáng)度為5。由于4CL的催化產(chǎn)物會(huì)對(duì)TAL/PAL的催化能力產(chǎn)生抑制，Wu等[39]針對(duì)這一現(xiàn)象構(gòu)建了均由T7啟動(dòng)子控制的4個(gè)質(zhì)粒模塊，將4CL克隆到拷貝數(shù)低的pACYCDuet-1載體上，而將CHS和CHI克隆到拷貝數(shù)最高的pRSFDuet-1載體上，這樣4CL表達(dá)水平為50而CHS和CHI為500，結(jié)果為4CL產(chǎn)物肉桂酰CoA會(huì)被相對(duì)過量CHS及時(shí)代謝而避免對(duì)PAL產(chǎn)生的反饋抑制，該組匹諾塞林產(chǎn)量較對(duì)照組 (PAL表達(dá)水平為200，CHS和CHI表達(dá)水平為100) 提升了3.4倍。

3.5 其他

宿主菌會(huì)對(duì)產(chǎn)率產(chǎn)生一定影響。在這一問題上，人們幾乎都選擇了大腸桿菌作為匹諾塞林的表達(dá)宿主菌?；蚬こ讨谐Ｓ玫恼婧松锝湍妇梢詫?duì)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，但是在黃酮的生物合成過程中很少選擇酵母菌。Jiang等[41]利用酵母構(gòu)建了匹諾塞林工程菌，其產(chǎn)量?jī)H為0.8 mg/L。酵母細(xì)胞與植物細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系更近，其含有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)能夠進(jìn)行NADPH的質(zhì)子傳遞，這為C4H的表達(dá)及活性的保持提供了良好的條件，但是人們?cè)谶x擇黃酮代謝途徑時(shí)往往繞開C4H，這可能是較少選擇酵母表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)原因。鏈霉菌具有細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)較快和基因操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，研究人員也嘗試選擇其作為匹諾塞林的宿主菌[31,42]。

此外，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步，人們不再局限在與目的產(chǎn)物直接相關(guān)的代謝途徑上，而是整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)。盡管細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)具有復(fù)雜性和代謝流動(dòng)態(tài)性，但計(jì)算機(jī)完全可以模擬胞內(nèi)情況，以便在更大范圍找到可調(diào)控點(diǎn)[43]。Fowler等[44]建立了CiED模型，通過模擬找到了18種提高丙二酰CoA的敲除基因方法并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Xu等[45]利用Optforce方法對(duì)大腸桿菌的碳代謝途徑進(jìn)行分析優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在對(duì)某些基因敲除后可以大大提升產(chǎn)量。

4 結(jié)論與展望

隨著基因工程和代謝工程的發(fā)展，合成生物學(xué)取得了巨大進(jìn)步，利用微生物合成黃酮類化合物也取得了令人矚目的成果，然而利用微生物發(fā)酵仍存在異源性表達(dá)效果不好、產(chǎn)率不高和代謝途徑各個(gè)環(huán)節(jié)之間不能最優(yōu)化適配等問題。研究人員正積極地運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)尋求提高黃酮類化合物產(chǎn)量的方法。作為我國(guó)自主研發(fā)的Ⅰ類新藥，匹諾塞林現(xiàn)已經(jīng)以注射劑的劑型進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)。對(duì)于這一具備成藥前景的化合物，利用微生物合成方法進(jìn)行生產(chǎn)不僅會(huì)大大降低市場(chǎng)價(jià)格，且有利于環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。合成生物學(xué)技術(shù)合成匹諾塞林的研究具有很好的科研價(jià)值和社會(huì)意義，如何更好地改善微生物合成方法合成匹諾塞林，將是研究者們亟待解決的下一個(gè)問題。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Progress in synthetic biology ofpinocembrin

Lei Guo, and Jianqiang Kong

Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products, Ministry of Health of PRC, State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Material Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

Pinocembrin, belonging to flavanons, was isolated from various plants. Pinocembrin has a variety of pharmacological activities, such as neuroprotective effect, antimicrobial activity, and antioxidant efficacy. Pinocembrin was approved as classⅠdrugs to its phase Ⅱclinical trial by CFDA in 2009, mainly used for the treatment of ischemic stroke. As a promising compound, the manufacturing technologies of pinocembrin, including chemical synthesis, extraction from plant and synthetic biology, have attracted many attentions. Compared with the first two technologies, synthetic biology has many advantages, such as environment-friendly and low-cost. Construction of biosynthetic pathway in microorganism offers promising results for large scale pinocembrin production by fermentation after taking lots of effective strategies. This article reviews some of recent strategies in microorganisms to improve the yield, with focus on the selection of appropriate the key enzyme sources, the supply of precursors and cofactors by microorganisms, the choice of substance and the level of the key enzyme expression.

pinocembrin, flavonoids, synthetic biology, fermentation strategies

July 14, 2014; Accepted:September 17, 2014

Jianqiang Kong. Tel: +86-10-63165169; E-mail: Jianqiangk@imm.ac.cn

Supported by: National Mega-project for Innovative Drugs (No. 2012ZX09301002).

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No. 2012ZX09301002) 資助。