唐偉　程德杰　魏嬌等

摘要：通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增獲得小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）的衣殼蛋白（CP）基因，將其連接原核表達(dá)載體pEHISTEV，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可以表達(dá)38 kD的融合蛋白。通過(guò)切膠回收的方法收集目的蛋白，免疫新西蘭長(zhǎng)耳兔，制備WYMV CP的多克隆抗體。間接ELISA測(cè)定該抗血清效價(jià)為1∶2 048，Western blotting分析表明該血清可以與病株中CP發(fā)生特異性反應(yīng)，而與健康植株汁液無(wú)反應(yīng)。該血清為WYMV的檢測(cè)及CP功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥黃花葉病毒；外殼蛋白；原核表達(dá)；抗血清；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S512.1：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）01-0088-04

Abstract The coat protein （CP） gene of wheat yellow mosaic virus （WYMV） was amplified by RT-PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce recombinant plasmid pEHISTEV-WYMVCP. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli strain Rosetta and expressed a 38 kD fusion protein after inducing by IPTG. The fusion protein was collected as antigen to immunize rabbits for production of polyclonal antiserum against WYMV CP. Finally the polyclonal antiserum was obtained with titer above 1∶2 048 by ELISA. With this antiserum， the WYMV CP in the infected wheat plant could be detected specifically by Western blotting. The resultant antibody will facilitate the detection of WYMV and the functional studies of WYMV CP.

Key words Wheat yellow mosaic virus； Coat protein； Prokaryotic expression； Antiserum； Detection

小麥黃花葉病是由馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）大麥黃花葉病毒屬（Bymovirus）的小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）引起的[1]。自20世紀(jì)70年代中國(guó)報(bào)道小麥黃花葉病以來(lái)，在長(zhǎng)江中下游、黃淮流域、四川盆地等小麥產(chǎn)區(qū)均有該病害的報(bào)道[2～8]。近年來(lái)，由于感病品種的大面積種植等原因，該病日趨嚴(yán)重，現(xiàn)全國(guó)發(fā)病面積達(dá)200×104 hm2， 每年減產(chǎn)在15×108 kg以上[9]。

WYMV為二分體正單鏈RNA病毒，病毒粒子彎曲線狀，有250～300 nm和550～700 nm兩種長(zhǎng)度。WYMV以土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxa graminis L.）為介體進(jìn)行傳播，侵染小麥造成危害。病毒在秋后即可侵染小麥，但不顯癥；在小麥返青期，葉片上產(chǎn)生花葉或者梭條形病斑，植株矮化。當(dāng)氣溫超過(guò)20℃時(shí)，病株隱癥。發(fā)病植株在成熟期表現(xiàn)為麥穗短小，籽粒不飽滿，產(chǎn)量下降[10，11]。

病毒的衣殼蛋白（Coat protein，CP）是具有多種功能的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒生活史的各個(gè)階段中具有重要的功能[12，13]；此外，病毒的CP能夠和病毒其他蛋白進(jìn)行互作共同行使某種功能，如癥狀表現(xiàn)[14，15]、病毒粒子裝配、病毒傳播[16，17]、復(fù)制[18]、RNA轉(zhuǎn)錄[19]、移動(dòng)[13， 20]、抑制寄主的RNA沉默[21，22]以及激活R基因調(diào)節(jié)的寄主抗性[23]等。

本研究在對(duì)山東小麥黃花葉病毒分子檢測(cè)的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR的方法，擴(kuò)增獲得WYMV CP基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中高效表達(dá)，通過(guò)免疫家兔制備了相應(yīng)的特異性抗血清，為WYMV檢測(cè)以及WYMV CP基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株Escherichia coli DH5α、Rosetta（DE3）及原核表達(dá)載體pEHISTEV均由本實(shí)驗(yàn)室保存；Taq DNA聚合酶、pMD18-T、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司； TransZol、反轉(zhuǎn)錄和PCR產(chǎn)物回收試劑盒、SDS-PAGE所用蛋白Marker購(gòu)自TransGen公司；硝酸纖維素膜為Pall Gelman公司產(chǎn)品；堿性磷酸酯酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG、福氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；Western blotting所用蛋白Marker購(gòu)自Thermo公司；IPTG、DTT、KCl等為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)及WYMV CP基因的克隆

根據(jù)2012年叢倩倩獲得的WYMV CP基因序列[24]設(shè)計(jì)PCR引物。正向引物為WYMV-CP-NcoⅠ-F（5′-CTA GCC ATG GCA GCT GAC ACA C-3′），反向引物為WYMV-CP-SalⅠ-R（5′-GCG TCG ACT TAG GTT AGT TCT GG-3′）。endprint

以山東泰安采集的WYMV病株為材料，參照TransZol試劑盒說(shuō)明，從新鮮病株提取總RNA。以提取的總RNA為模板， 在引物Oligo（dT）18引導(dǎo)下利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，使用PCR凝膠回收試劑盒回收目的片段。連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.3 cp基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)

將獲得的目的片段經(jīng)NcoⅠ和SalⅠ雙酶切后，與經(jīng)過(guò)相同酶切處理的pEHISTEV進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒（pEHISTEV-WYMVCP）轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。挑取單斑接種到3 mL含50 mg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃活化過(guò)夜。取200 μL 培養(yǎng)過(guò)夜的菌液放入20 mL（1∶100）含50 mg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4～6 h，離心收集菌體。加適量TE緩沖液（pH 8.0）振蕩懸浮，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)情況。

1.4 抗血清制備、效價(jià)及特異性測(cè)定

從凝膠上直接回收表達(dá)的蛋白條帶[25]，用適量生理鹽水稀釋后，加入等體積的福氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，采用皮下注射法免疫新西蘭長(zhǎng)耳兔。每隔1周注射1次，共5次。最后一次注射1周后采血，收集抗血清，分裝后-20℃貯存。利用ELISA測(cè)定抗血清的效價(jià)，Western blotting分析抗血清的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 WYMV CP基因克隆及原核表達(dá)

通過(guò)RT-PCR從病株中擴(kuò)增到一條特異的900 bp左右的DNA片段（圖1），與預(yù)期大小相符?？寺『鬁y(cè)序發(fā)現(xiàn)其大小為882 bp，Blast結(jié)果表明該片段為WYMV cp基因。

將該基因酶切、連接到原核表達(dá)載體pEHISTEV的多克隆位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pEHISTEV-WYMVCP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后取菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)在38 kD左右出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶（圖2），與預(yù)期大小一致，說(shuō)明外源蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)。利用BandScan5.0檢測(cè)蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)pEHISTEV-WYMVCP目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量占菌體總蛋白的34.0%。

2.2 抗血清制備及特異性檢測(cè)

將切膠回收的蛋白條帶乳化后免疫家兔，注射5次后獲得WYMV CP抗血清。以WYMV侵染的小麥和健康小麥為材料，用獲得的抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。結(jié)果顯示W(wǎng)YMV侵染的小麥樣品在38 kD處出現(xiàn)了特異性的條帶，而健康小麥樣品無(wú)特異性免疫反應(yīng)（圖3），說(shuō)明以原核表達(dá)的WYMV CP蛋白為抗原制備的抗血清能夠特異地與病株中WYMV CP蛋白結(jié)合。

2.3 抗血清的效價(jià)

以健康小麥樣品為陰性對(duì)照，以WYMV侵染的小麥樣品為材料，使用間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，該抗體的效價(jià)可以達(dá)到1∶2 048（表1），表明該抗體效價(jià)相對(duì)較高。

3 結(jié)論與討論

病毒CP蛋白涉及病毒生活史的各個(gè)階段，在病毒粒子形成與病毒生物學(xué)中發(fā)揮作用

[12，13]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，WYMV的CP蛋白在其VPg蛋白核質(zhì)穿梭過(guò)程中具有重要作用[26]。

在制備抗血清過(guò)程中，由于有些植物病毒在植株體內(nèi)含量較低，不易獲得大量的抗原，提純的病毒粒子外殼蛋白容易在純化的過(guò)程中丟失，而且利用傳統(tǒng)的病毒提純方法無(wú)法完全去除寄主植物蛋白，制備的抗血清易產(chǎn)生假陽(yáng)性。利用原核表達(dá)的方法可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量目的蛋白，成為制備抗血清常用的方法。向榮[27]、楊狄[28]等利用原核表達(dá)方法獲得WYMV P1、P2蛋白，并成功獲得WYMV抗血清。韓成貴等利用pET-30a（+）載體表達(dá)了WYMV CP融合蛋白，其N-端包含55個(gè)載體氨基酸，制備的血清成功用于小麥黃花葉病的檢測(cè)[29，30]。

本研究利用了pEHISTEV原核表達(dá)載體，所表達(dá)的蛋白僅包含25個(gè)非病毒蛋白氨基酸。利用原核表達(dá)獲得的CP蛋白免疫家兔獲得了效價(jià)為1∶2 048的WYMV抗血清，該血清與病株中的WYMV CP有特異反應(yīng)，而與健康植株無(wú)反應(yīng)，說(shuō)明制備的抗體有較高的效價(jià)和良好的特異性，可用于WYMV樣品的ELISA和Western blotting檢測(cè)。在Western blotting檢測(cè)病株葉片時(shí)，還出現(xiàn)了小于38 kD的條帶，這可能是由于寄主葉片細(xì)胞的衰老，導(dǎo)致病毒CP蛋白的水解。類似情況也在小麥條紋花葉病毒（Wheat streak mosaic virus，WSMV）CP蛋白的檢測(cè)中出現(xiàn)[31，32]。

抗血清的制備對(duì)檢測(cè)小麥黃花葉病的發(fā)生、明確小麥黃花葉病原以及預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)具有積極作用，為深入研究CP功能奠定了基礎(chǔ)。

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