閔陽，李寶娥，李鶯，李海鵬，梁春永，王洪水

（1.河北工業(yè)大學材料科學與工程學院，天津 300130；2.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院，天津 300070）

陽極氧化法改善鈦表面的生物活性和生物相容性

閔陽1，李寶娥1，李鶯2，李海鵬1，梁春永1，王洪水1

（1.河北工業(yè)大學材料科學與工程學院，天津 300130；2.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院，天津 300070）

采用陽極氧化法在鈦金屬表面成功制備了均勻的納米結構，生成的納米管內(nèi)徑約70nm，壁厚20nm，管長200 nm．通過模擬體液浸泡實驗對植入體的生物活性進行了評價，并通過體外細胞培養(yǎng)實驗對生物相容性進行了評價．結果表明：經(jīng)模擬體液浸泡4周后，陽極氧化處理后的鈦表面可誘導磷灰石生成，而僅經(jīng)過機械打磨的鈦金屬表面不能．細胞培養(yǎng)實驗表明，陽極氧化處理后的鈦相較于未處理的鈦，有利于細胞在其表面粘附和增殖．基于上述研究結果可知：陽極氧化處理后的鈦表面，提高了表面的粗糙度和親水性，從而改善了鈦的生物活性和生物相容性．

鈦；陽極氧化；納米管；生物活性；生物相容性

0 引言

由于具有優(yōu)良的生物相容性和機械性能，鈦（Ti）及其合金是臨床醫(yī)學最常用的牙科和骨科移植材料[1-2]．但是，鈦的生物惰性常常導致鈦植入物與骨組織結合不良，增加長期使用后植入物松動的風險，這在一定程度上限制了鈦植入物的應用．

為了改善鈦植入物的生物學性能，研究者們采用了一系列方法對其進行表面改性，例如機械法（例如：噴砂法[3]，飛秒激光刻蝕法[4]）、化學法（例如：酸蝕法[2-3]）以及覆層法（例如：羥基磷灰石[5]，硅鈣石[6]）．這些方法通過在鈦表面構建有利于細胞生長的結構和涂層物質，實現(xiàn)了生物學性能的改善．但是，迄今為止這些方法的1個不足在于，無論是化學法還是機械法都不能得到高度可控的表面結構．此外，一些方法還有可能形成表面殘余物，對成骨細胞產(chǎn)生有害作用[7]．因此，在鈦表面制備高度可控的表面結構以改善鈦植入物的生物學性能具有重要研究意義．

陽極氧化法可在鈦表面形成高度可控的納米結構，且陽極氧化法是一種簡單、經(jīng)濟、易操作的電化學方法，目前已在多種金屬和合金上形成均勻可控的納米結構（例如：氧化鋁，鈦合金）[8]．但是，這些納米結構主要用于改良腐蝕性或耐磨性、改變金屬顏色、提高結合強度等方面[9-11]．在生物醫(yī)學領域的應用卻很少有人報告[12]．

因此，本研究的目的就是通過陽極氧化技術在鈦表面制備高度可控的納米結構，然后探究納米結構表面對生物學性能（生物活性和生物相容性）的影響；通過考察材料在模擬體液中誘導磷灰石生成的能力對鈦植入物的生物活性進行評估；通過測定體外細胞在材料表面的黏附和增殖來評估材料的生物相容性．

1 材料與方法

1.1 制備樣品

實驗所用鈦片為市售TA1鈦板，線切割為10mm×10mm×1mm后，用#1000SiC砂紙打磨處理，然后分別在丙酮、乙醇和去離子水中超聲清洗5min，再使用直流（dc）電壓源（WYK-150，中國揚州）進行陽極氧化實驗．陽極氧化處理過程中，鈦板作為陽極，石墨（40mm×40 mm×5mm）作為陰極，兩極間距為40 mm，1 mol/L NaF溶液用作電解液，在10V電壓和室溫條件下陽極化反應1h．陽極氧化處理后，對樣品進行清洗、干燥、進行后續(xù)實驗測試．為了進行比較，未經(jīng)陽極氧化處理的打磨鈦板用作對照組樣品．

1.2 表面表征

利用場發(fā)射掃描電鏡（SEM，HITACHI S-4800）觀察所得樣品的表面形貌．通過X射線衍射（XRD）分析晶體結構．利用原子力顯微鏡（AFM，Agilent5500）測定表面粗糙度，根據(jù)室溫下去離子水與樣品表面的接觸角對親水性進行評估．為了避免重力和蒸發(fā)引起形狀改變，接觸角測量中選擇水滴體積為2L．利用顯微鏡上的數(shù)碼攝像頭（1280×960像素）得到水滴的圖像，然后采用圖像分析軟件處理圖像．

1.3 生物活性評估

將陽極氧化處理前后的樣品浸泡在37℃的模擬體液（SBF）中靜置，考察類骨磷灰石在其表面的生成情況．SBF中的離子濃度幾乎等于人體血漿中的離子濃度．SBF的制備方法是，在36.5℃將分析純的NaCl、NaHCO3、KCl、KH2PO43H2O、MgCl26H2O、CaCl2和Na2SO4依次溶解在去離子水中，通過45mmol/L三甲基氨基甲烷（(CH2OH)3C(NH2)）和1mol/LHCl將試樣pH值調(diào)為7.4．樣品在SBF中靜置4周后，利用SEM和XRD研究樣品表面的磷灰石生成情況．

1.4 生物相容性的評估

進行細胞培養(yǎng)實驗之前，將樣品在121℃下通過高壓蒸汽滅菌30min．將天津醫(yī)科大學提供的MC3T3-E1小鼠前成骨細胞接種到樣品表面，接種密度為1×104個/cm2．細胞培養(yǎng)液為含有10%牛胎血清（Hyclone，Logan，USA）和3%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（GibcoBRL，USA）．將細胞置于37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)1d、4d和7d后，分別用MTT（3-4,5-二甲基噻唑-2-yl-2,5-二苯基四唑溴化物，Sigma）比色度檢測法對樣品表面的細胞增殖進行評估[13]．為了觀察樣品表面的細胞附著情況，將樣品表面附著的細胞在2.5%的戊二醛溶液中固定4h，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）沖洗2次、梯度乙醇脫水、臨界點干燥，在表面噴金后，用SEM觀察細胞形態(tài)．

1.5 統(tǒng)計學分析

通過一維方差分析不同組實驗變量間有無顯著差異．每組變量至少包含3個有效值，顯著差異水平設定為p=0.05．

2 實驗結果

在NaF溶液中陽極氧化處理后，鈦表面形態(tài)發(fā)生顯著變化，如圖1，圖2所示．

相比于打磨鈦的光滑表面，陽極氧化處理使得鈦表面形成了尺寸均勻的納米管陣列．納米管內(nèi)徑約為70nm，管壁厚度約為20nm，管長約為200nm．由于表面粗糙度和親水性是關系到材料生物學性能的兩大重要因素，樣品的表面粗糙度和親水性分別用AFM和接觸角儀進行了測定，實驗結果如圖3～圖6所示．

AFM法測得陽極氧化鈦表面的粗糙度為200 nm，明顯大于打磨鈦片的粗糙度數(shù)值（約為40 nm）．且陽極氧化處理可使得去離子水在其表面的接觸角從大約90°下降至大約32°，表明陽極氧化可將疏水的鈦表面轉變?yōu)橛H水表面．

圖1 打磨鈦的表面形貌Fig.1 Surfacemorphologyoftheas-polishedTisamples

圖2 陽極氧化處理鈦的表面形貌Fig.2 SurfacemorphologyoftheanodizedTisamples

圖7～圖8為陽極氧化處理前后的鈦表面經(jīng)SBF浸泡4周后的表面形貌圖．

圖3 打磨鈦的表面粗糙度Fig.3 Thesurfaceroughnessoftheas-polishedTisamples

圖4 陽極氧化鈦的表面粗糙度Fig.4 ThesurfaceroughnessoftheanodizedTisamples

圖5 打磨鈦的接觸角Fig.5 Thehydrophilicityoftheas-polishedandTisamples

圖6 陽極氧化鈦的接觸角Fig.6 ThehydrophilicityoftheanodizedTisamples

圖7 打磨鈦經(jīng)SBF浸泡4周的表面形貌Fig.7 Surfacemorphologiesoftheas-polishedTi samplesafterimmersioninSBFforfourweeks

可以看出打磨的鈦表面經(jīng)SBF浸泡后，表面形貌并無明顯改變，表明沒有形成磷灰石．而陽極氧化處理后的鈦表面均勻地形成了一層物質，覆蓋了TiO2納米管結構．經(jīng)XRD圖譜證實，這層新生成的物質為磷灰石．這些結果說明納米管結構可誘導磷灰石在其表面生成，陽極氧化處理能夠提高鈦的生物活性．

在陽極氧化處理前后的鈦表面，細胞增殖情況如圖9所示．

可以看出，培養(yǎng)1 d后，2種樣品表面的細胞數(shù)量沒有統(tǒng)計學差異（p＞0.05）．隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量逐漸增多．到第4d時，陽極氧化處理后的鈦表面，其細胞數(shù)量明顯高于對照打磨鈦片（p＜0.05）．到第7 d時，陽極氧化處理后的鈦表面細胞數(shù)量大約為對照打磨鈦表面上的2倍．從而揭示出，鈦表面經(jīng)陽極氧化處理后能夠加速細胞增殖．細胞在陽極氧化處理前后的鈦表面培養(yǎng)7d后，其形貌如圖10～圖11所示．

可見，對照打磨鈦表面的細胞形態(tài)，陽極氧化處理有利于細胞在其表面的鋪展、增殖．

3 討論

許多研究者都指出材料表面結構會影響細胞的反應，也會影響在植入物與宿主組織之間起連接作用的組織生長．研究表明，納米結構表面的尺度接近于天然骨結構，將給細胞附著、增殖能力以及造骨能力帶來有利影響，更好地實現(xiàn)骨整合．此外，納米結構提供的高比表面積，特別是納米結構之間的空隙，能為骨細胞結合和體液滲透創(chuàng)造有利條件，有效改善骨與植入物的結合．

圖8 陽極氧化處理鈦經(jīng)SBF浸泡4周的表面形貌Fig.8 SurfacemorphologiesofanodizedTi samplesafterimmersioninSBFforfourweeks

圖9 打磨鈦、陽極氧化處理鈦經(jīng)MTT法測試在不同時間下成骨細胞的增殖情況Fig.9 MTTassayrepresentingtheMC3T3-E1cellproliferationontheas-polishedandanodizedTisurfaces

圖10 打磨鈦表面的細胞形貌Fig.10 Cellproliferationontheas-polishedTisamples

圖11 陽極氧化鈦表面的細胞形貌Fig.11 CellproliferationontheanodizedTisamples

此外，許多研究均表明材料表面的粗糙度和親水性也會影響細胞的行為[15]．在本研究工作中，與對照打磨鈦表面相比，陽極氧化處理生成的無定形TiO2納米管陣列粗糙度高、親水性好．親水性得到提高的原因可能是材料表面形成了大量OH基團[16]．已有研究者通過表面粗化處理提高鈦表面親水性，并證實該表面能夠增大細胞附著蛋白質的吸附量[17]．此外，親水性基質表面也已被證實可促進成骨細胞的附著、生長和基因表達．本研究中，通過陽極氧化處理提高鈦表面的粗糙度和親水性，進而促進了細胞在表面的黏附、增殖，這與文獻中報道的一致，親水表面含有豐富的OH基團（Ti-OH），它與模擬體液中的氫氧根離子反應使得鈦表面形成大量的負電荷（Ti-O）．這些負電荷能夠吸引SBF溶液中帶正電的鈣離子．進而由帶正電的鈣離子將帶負電的HPO24離子吸引到鈦表面，形成一種由磷酸氫鈣組成的含水前驅體．之后，它們依靠消耗周圍體液中的鈣離子和磷酸鹽離子自發(fā)生長，最后晶化成磷灰石結構．

在本研究中，證明了陽極氧化處理能夠提高鈦表面的粗糙度和親水性，從而改善了鈦的生物活性和生物相容性．但是，今后還需進一步優(yōu)化納米管的尺寸，獲得最佳的生物學性能．

4 結論

本文采用陽極氧化法在鈦表面制得尺寸均勻的納米管陣列結構．納米管內(nèi)徑約為70nm，管壁厚度約為20 nm，管長約為200nm．納米管的形成提高了鈦表面粗糙度和親水性，有利于磷灰石生成，并促使細胞在其表面黏附、增殖，表現(xiàn)出優(yōu)良的生物活性和生物相容性．

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[責任編輯 田豐]

Improvementofsurfacebioactivityandbiocompatibility ontitaniumbyanodicoxidation

MINYang1，LIBaoe1，LIYing2，LIHaipeng1，LIANGChunyong1，WANGHongshui1

(1.SchoolofMaterialsScienceandEngineering,HebeiUniversityofTechnology,Tianjin300130,China;2.StomatologicalHospital,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Anodicoxidationwasappliedtoproduceahomogeneousanduniformarrayofnanotubesonthesurfaceoftitanium(Ti)implants.Theinnerdiameterofthenanotubes wasabout70nm,thewallthicknesswasaround20nm,andthedepthwasabout200nm.ThebioactivityoftheTiimplantswasevaluatedbysimulatedbodyfluidsoakingtest.The biocompatibilitywasinvestigatedbyvitrocellculturetest.Theresultsshowedthatbone-likeapatitewasformedontheanodizedTisurface,butnotontheas-polishedTisurfaceafter immersioninsimulatedbodyfluidforfourweeks.CellsculturedontheanodizedTisurfaceshowedenhancedcelladhesionandproliferation,alsopresentedanup-regulatedgeneexpressionofosteogenicmarkersOPNandOCN,comparedtothoseculturedontheas-polishedTisurface.Basedontheseresults,itcanbeconcludedthatanodicoxidationimproved thebioactivityandbiocompatibilityofTisurface,whichwasattributedtotheformationofnanostructuredsurfaceaswellasthenanosurfaceinducinghighsurfaceroughnessandhydrophilicity.

Titanium;anodicoxidation;nanotube;ioactivity;biocompatibility

R318.08

A

1007-2373(2015)06-0063-05

10.14081/j.cnki.hgdxb.2015.06.012

2015-03-17

國家自然科學基金（51171058，51201056）；中國科學院無機涂層材料重點實驗室開放基金（KLICM-2012-02）；河北省自然科學基金（E2013202021，E2013202022）；河北省科技計劃項目（13211027）；天津市科技特派員項目（14JCTPJC00496）

閔陽（1989-），男（漢族），碩士生．通訊作者：李寶娥（1979-），女（漢族），副教授，libaoe@hotmail.com．

數(shù)字出版日期：2015-11-18數(shù)字出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/13.1208.T.20151118.1047.004.html