李 超,梁俊峰

(1.中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所, 廣東 廣州 510520；2.國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022)

土壤微生物總DNA提取及其PCR優(yōu)化

李 超1,2,梁俊峰1＊

(1.中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所, 廣東 廣州 510520；2.國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022)

采用3種不同土壤微生物總DNA提取方法對廣東省樂昌楊東山十二度水自然保護區(qū)的樣地土壤進行比較研究，進一步通過PCR擴增，研究牛血清白蛋白(BSA)對整個PCR擴增過程的影響。結(jié)果表明：試劑盒提取法相對于其他兩種提取方法更加方便有效，當土壤樣品量比較大時，直接提取法是最經(jīng)濟有效的方法；而在土壤微生物的PCR擴增實驗中，加入2 μl的BSA，可以有效地抑制腐殖酸等對后續(xù)PCR擴增的影響。

土壤微生物；DNA提取；牛血清白蛋白；PCR擴增

傳統(tǒng)上，利用微生物形態(tài)、培養(yǎng)特性、生理生化特性及遺傳特性作為依據(jù)對微生物進行分類和鑒定來研究微生物多樣性制約因素很多，且 85% ~ 99%的環(huán)境微生物不能被分離識別[1]。近年，基于PCR技術(shù)的分子生物學方法應(yīng)用于土壤微生物多樣性研究已成為一種趨勢，彌補了傳統(tǒng)土壤微生物培養(yǎng)和鑒定方法不能真實反映待測環(huán)境的不足[2-3]。土壤理化性質(zhì)十分復(fù)雜，粗提取的土壤DNA中均含有腐殖酸、酚類化合物和重金屬離子等抑制性污染物，其中腐殖酸是土壤的主要成分，微量的腐殖酸即可抑制PCR擴增中的TaqDNA聚合酶以及酶切反應(yīng)的限制型內(nèi)切酶活性[4-6]，且腐殖酸在 DNA的提取過程中出現(xiàn)與 DNA共提取的現(xiàn)象，并和DNA緊密結(jié)合，導(dǎo)致其很難與DNA分離[7-8]。因此，如何減少腐殖酸的抑制作用，獲得良好的PCR擴增結(jié)果成了土壤微生物多樣性研究的關(guān)鍵。

Tebbe等[5]研究發(fā)現(xiàn)0.08 μg·m L-1腐殖酸足以抑制PCR擴增中極為敏感的Taq聚合酶活性，因此DNA稀釋后再進行PCR擴增可降低腐殖酸等抑制物的濃度，從而顯著減少其抑制作用。A l-Soud等[9]通過離子交換色譜成像系統(tǒng)和熒光定量 PCR儀等來鑒定和純化人體血細胞內(nèi)的 PCR擴增抑制物成分，結(jié)果表明血紅蛋白和乳鐵蛋白中的9種擴增促進劑中牛血清白蛋白(BSA)的效果最明顯。Forbes等[10]通過內(nèi)部控制實驗研究抑制用于直接檢測臨床樣本的結(jié)核分枝桿菌PCR實驗的干擾物質(zhì)，數(shù)據(jù)結(jié)果表明 BSA在直接檢測呼吸道標本的結(jié)核分枝桿菌的PCR反應(yīng)中至關(guān)重要。

國內(nèi)外關(guān)于土壤微生物總DNA提取方法的研究很多，而土壤質(zhì)地和成分的差異也會影響土壤微生物DNA的提取效果[11]，提取的方法也有一定的差異。本研究對廣東省樂昌楊東山十二度水自然保護區(qū)樣地的土壤微生物進行了比較，以期找到一種快速、簡便、高效的DNA提取方法用于后續(xù)土壤微生物多樣性和種群變化的研究。

1 試驗地概況

楊東山十二度水省級自然保護區(qū)位于廣東省韶關(guān)市樂昌東北部，該保護區(qū)正北面與湖南省接壤，自北向南跨越九峰、五山、北鄉(xiāng)、廊田四鎮(zhèn)和龍山林場。地理位置為 113°23′09″ ~ 113°29′32″ E，25°22′47″ ~ 25°11′06″ N，總面積11 651 hm2，光照充足、溫暖濕潤、雨量充沛，屬于中亞熱帶季風氣候[12]。土壤類型主要有山地紅壤、山地黃壤、山地灌叢草甸土、石灰土和水稻土。地貌特征屬于南嶺山地，最高海拔1 726.6 m。該區(qū)年均氣溫18.1 ~ 19.9℃，年降水量超過1 700 ~ 1 800 mm。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

2008年9月在廣東省樂昌楊東山十二度水自然保護區(qū)的樣地進行土壤樣品采集，樣地面積50 m × 30 m，并細分為10 m × 10 m的樣方，采樣時盡量在相對平坦、地表植被覆蓋較好的地方采集土壤樣品，采用五點采樣法取地表下0 ~ 15 cm土樣混合均勻后裝入無菌自封袋，貼上標簽，帶回實驗室放入?20℃冰箱保存用于后續(xù)實驗。樣品保存時間不超過1周。

2.2 研究方法

2.2.1 土壤微生物總DNA的提取及純化

2.2.1.1 直接提取法

參照蘆曉飛等[8]的DNA提取方法稍改進。

2.2.1.2 真菌提取法

(1) 將采集的土壤樣品用孔徑25目的分樣篩混勻篩除沙石并分裝，稱取樣品1 ~ 3 g，置于10 m L滅菌離心管；(2) 加5 m L TENP (pH=10.0) ，混勻3 min (在搖床上搖5 m in，37℃ 250 rpm)，再12 000 rpm離心3 m in，去上清。(3) 重復(fù)3 ~ 4次或更多，直至上清液較清；(4) 加入PBS 5 m L，混勻3 ~ 5 min，12 000 rpm 離心3 min，棄上清；(5) 加入65℃預(yù)熱好的4 × CTAB提取液5 m l，混勻，置于65℃水浴2 ~ 3 h，其間搖勻4 ~ 5次(4 × CTAB：1 L溶液中，1 M Tris-HCl 100 m L (pH 8.0)，NaCl 82 g，0.5 M EDTA 40 m L (pH 8.0)，CTAB 40 g，PVP 2 g)；(6) 加入等體積氯仿：異戊醇(24:1)，顛倒混勻，12 000 rpm 離心15 m in，取上清；(7) 加入等體積的異丙醇沉淀，放入 4℃冰箱保存過夜；(8) 離心10 min，去上清，用70%酒精和無水乙醇3 m L各洗1次，晾干后加入30 μl ddH2O或TE。

2.2.1.3 試劑盒提取法

按照生工生物有限公司提供的 Ezup柱式土壤基因組 DNA抽提試劑盒操作步驟提取土壤總DNA。

2.2.2 PCR擴增及電泳檢測

在rDNA基因中，16S rDNA和28S rDNA基因間隔序列稱為(ITS)，它的長度和序列變化較大，將其擴增物進行序列分析，可用于對真菌的不同生物型、菌株、種、屬進行分類鑒定。采用通用引物ITS1和 ITS4來擴增核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNAITS)。引物：ITS 1 (5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’)和ITS 4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3’)。PCR體系(50 μl)：ITS 12 μl，ITS 42 μl，10 × Buffer 5 μl，dNTP 5 μl，Taq酶0.8 μl，超純水31.2 μl，模板2 μl，BSA(牛血清白蛋白) 2 μl (2.0 mg·m l-1)。土壤真菌PCR擴增程序：35 cycles，95℃5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 2 m in；72℃ 7 min。檢測：1.0%瓊脂糖電泳進行檢測，并拍照記錄。

2.2.3 擴增片段的純化回收

選用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的多功能DNA純化回收試劑盒，得到的DNA溶液置于?20℃保存或者直接用于后續(xù)實驗。檢測：1.0%瓊脂糖電泳進行檢測，并拍照記錄。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA顏色及量的比較

直接法提取的土壤總DNA量最多，顏色呈深褐色，其次為真菌提取法，顏色最淡的為試劑盒提取的DNA，結(jié)果表明直接法提取的DNA含有腐殖酸等雜質(zhì)較多，但提取的DNA總量也多，試劑盒屬于微量提取法，獲得的DNA純度較高，試劑盒提取更方便快捷，但費用相對較高。

3.2 電泳檢測結(jié)果

用1% 瓊脂糖在1 × TAE緩沖液中進行電泳檢測，每條電泳道加5 μl DNA原樣。由圖1可知，直接法提取的A1、B1、C1、D1四個土壤樣品的總DNA電泳圖，條帶較清晰，亮度最大，質(zhì)量較好；A2、B2、C2、D2為真菌法提取樣品的DNA，條帶最模糊，亮度最低，但對大型真菌的總DNA的提取效果卻很好；A3、B3、C3、D3為試劑盒法提取的4個土壤樣品的總DNA，條帶很清晰，含雜質(zhì)量最少，但亮度稍微比直接法低，說明直接提取法的總DNA量最大，由于試劑盒成本昂貴，少量提取是可行的，如果土壤樣品量需求比較大，最經(jīng)濟有效的方法為直接提取法。

3.3 PCR擴增結(jié)果

由于試劑盒提取的DNA溶液仍會含有少量的腐殖酸等物質(zhì)，而微量的腐殖酸即可抑制PCR擴增中Taq聚合酶及限制性內(nèi)切酶的活性，通過查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白(BSA)廣泛應(yīng)用于酶反應(yīng)及PCR反應(yīng)系統(tǒng)中，用來減少內(nèi)源抑制物的干擾作用[13]，BSA的加入，能夠減小活性污泥微生物樣品中殘留腐殖酸和棕黃酸等雜質(zhì)在 PCR擴增中的抑制作用[14]。不同研究采用的 BSA最適濃度不同，本研究采用的BSA濃度為2.0 mg·m l-1。通過實驗還發(fā)現(xiàn)，對于本研究的土壤及腐殖質(zhì)層樣品進行PCR的過程中，設(shè)計從50 ~ 60℃的退火溫度，擴增結(jié)果的變化不是太大，而以55℃效果最佳。本實驗?zāi)０錎NA為采用試劑盒提取法提取的總DNA稀釋5倍后取2 μl作為擴增模板。

由圖2可知，左邊4個條帶A1、B1、C1、D1為PCR反應(yīng)體系中未加BSA的4個樣品PCR擴增結(jié)果，條帶若隱若現(xiàn)，很難看到；中間4個條帶A2、B2、C2、D2為50 μl體系中加入2 μl BSA的擴增結(jié)果，條帶清晰；右邊4個條帶A3、B3、C3、D3為50 μl體系中加入5 μl BSA的擴增結(jié)果，有條帶，但不如2 μl BSA的擴增結(jié)果清晰。因此，在土壤微生物的PCR擴增實驗，加入適量的BSA，可有效地抑制腐殖酸等的污染，對實驗結(jié)果產(chǎn)生很好的優(yōu)化作用，且本次實驗加入BSA的量為2 μl效果最好，因此添加 BSA是一種既經(jīng)濟又有效的輔助措施。

4 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，3種DNA提取方法均可提取本研究樣地土壤基因組總DNA，但每種方法獲得的結(jié)果存在一定的差異，試劑盒提取法快速便捷，但實驗成本相對較高，適用于在較短時間內(nèi)獲得直接用于PCR擴增的較高純度的DNA，不適合進行樣品量需求較大的研究。因此針對不同土壤類型，應(yīng)該選擇合適簡便有效的DNA提取方法。

實驗過程中還發(fā)現(xiàn)DNA總濃度越高，PCR擴增的效果越不理想，而把DNA濃度稀釋后在電泳中已檢測不到條帶，也能有較理想的 PCR擴增結(jié)果，說明對粗提取的DNA進行稀釋也是減少雜質(zhì)影響的有效途徑。鮑立新等[14]以有機廢水厭氧生物處理系統(tǒng)中的活性污泥為樣本，研究了BSA對PCR擴增的影響。結(jié)果表明，通過條件優(yōu)化，提高了圖譜的分辨率和可讀性，添加BSA前后形成的SSCP圖譜條帶的多樣性基本不變，但加BSA后的條帶更加清晰，可讀性更強。本實驗也證明了在森林土壤微生物群落多樣性研究的樣品PCR擴增時，添加適量 BSA有助于降低樣品中殘留腐殖酸等的抑制作用，使PCR結(jié)果更加顯著，是一種可嘗試的優(yōu)化手段。當然影響PCR擴增的因素還有很多，試劑的濃度、反應(yīng)的條件及實驗步驟的優(yōu)化均有可能影響到實驗的最終結(jié)果。

關(guān)于如何快速有效地提取土壤中的總DNA，并適合后續(xù)的PCR擴增反應(yīng)的研究很多[11,15-17]。而根據(jù)不同的土壤類型及森林類型，方法各異。近年，基于 PCR技術(shù)的分子生物學方法已大量地應(yīng)用于土壤微生物多樣性研究，因此選擇合適的DNA提取方法，把 PCR反應(yīng)體系中各因子優(yōu)化到最佳濃度，并把BSA合理地運用到土壤微生物PCR反應(yīng)體系中成為了整個土壤微生物實驗的關(guān)鍵。

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Comparison of Extraction M ethods For Soil M icrobe DNA and Effectiveness of BSA for PCR Amp lification

LI Chao1,2, LIANG Jun-feng1
(1. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China; 2. China Eucalypt Research Centre, Zhanjiang 524022, Guangdong, China)

The extracting efficiency of three methods for soil DNA extraction and isolating of m icrobial soil DNA from sites in Yangdongshan Shierdushui Nature Reserve was examined. A lso, the effect of bovine serum albumin (BSA) on PCR amplification of the DNA obtained was studied. The results showed that the DNA Extraction Kit method was the most simple and effective method. However, for large numbers of soil samples, the most economical method proved to be ‘the direct method’. It was found that 2 μl BSA could inhibit the deleterious effects of humic acid on PCR amplification of soil m icrobe DNA.

soil m icrobes; DNA extraction; BSA; PCR amplification.

S154.3

A

2015-04-27

中國林業(yè)科學研究院基本科研業(yè)務(wù)費專項( CAFYBB2014MA003)和廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新重點項目( 2014KJCX019-01)

李超(1987— )，女，碩士，助理工程師，主要從事土壤微生物及遺傳多樣性研究

＊梁俊峰為通訊作者