余中華等

摘 要 為提高海洋微生物的可培養(yǎng)性，采用海水需求實驗分離海洋細菌的方法，分離出9株嚴格依賴海水生長的細菌。通過16S rDNA測序及同源性分析發(fā)現(xiàn)：菌株HB10001（=CGMCC 1.10781T）與Spongiibacter tropicus DSM19543T的16S rDNA序列同源性最高，為96.3%，其（G+C）含量為66.7 mol%；菌株HB10303與Paenibacillus. agaridevorans DSM1355T的16S rDNA序列同源性最高，為98.4%，其（G+C）含量為45.5 mol%。

關(guān)鍵詞 依賴海水；細菌；分離培養(yǎng)

分類號 Q933

Isolation and Characterization of Seawater Required Bacteria

YU Zhonghua1，2） LIU Jiayang1） CHEN Fujia1） BAO Shixiang2）

（1 Huanghuai University， Zhengzhou， Henan 450000， China

2 Institute of Tropical Biosciences and Biotechnolog Key Laboratory of Ministry

of Agriculture for Tropical Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract In order to increase the cultivability of seawater-required bacteria， 9 strains were isolated for their seawater requirements. strain HB10001（=CGMCC 1.10781T） had the highest sequence similarity with Spongiibacter tropicus DSM19543T（96.3%）. The G+C content is 66.7 mol%. Strain HB10303 had the highest sequence similarity with Paenibacillus agaridevorans DSM1355T（98.4%）. The G+C content is 45.5 mol%.

Keywords seawater required ； bacteria ； isolation

海洋微生物對海水中鹽的組分和濃度有不同程度的依賴性，因此，在設(shè)計培養(yǎng)基時，需要考慮海鹽對海洋微生物生長的影響[1]。有些海洋微生物的培養(yǎng)離不開海水，所以在培養(yǎng)基中添加海水是必不可少的。Mincer[2]發(fā)現(xiàn)的海孢菌Marinospora spp.和鹽孢菌Salinispora spp.只能在海水配制的培養(yǎng)基上生長。Han等[3]從阿穆爾斯基海灣中分離到的Salinibacterium amurskyense gen. nov. sp. nov是Microbacteriaceae的一個新屬。這類菌株能耐受濃度高達10%的NaCl，不過NaCl對其生長則并非必需，說明該菌株對海洋環(huán)境有良好的適應(yīng)性。Tsueng等[4]對海水中的陽離子及離子強度對Salinispora的3個種S. pacifica，S. arenicola和S. tropica生長的影響進行了初步研究，結(jié)果表明，鈣離子和二價鎂離子及某些特定的離子強度對于Salinispora spp.的生長是必需的。Zhang等[5]采用5種不同培養(yǎng)基，分別對5種海綿中可培養(yǎng)放線菌進行分離，證明培養(yǎng)基對可培養(yǎng)微生物的數(shù)量有顯著影響；其中，在無機鹽成分最為豐富的M3培養(yǎng)基上分離到的菌群也具有最大的多樣性。

本研究針對海洋細菌的特殊生存進化環(huán)境，通過在R2A寡營養(yǎng)培養(yǎng)基中添加海水、純水及NaCl溶液模擬海洋環(huán)境，提高海洋微生物的可培養(yǎng)性，最大程度地分離培養(yǎng)依賴海水的細菌，并分離出新的未培養(yǎng)細菌。同時，利用多相分類方法對分離出來的細菌進行系統(tǒng)分類和鑒定，探明它們的種屬特性和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位，進一步豐富海洋微生物資源庫，以期為后期新基因、新化合物研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海洋細菌分離培養(yǎng)基

R2A培養(yǎng)基（海水）：0.05 g細菌學(xué)蛋白胨，0.05 g酵母粉，0.05 g可溶性淀粉，0.05 g葡萄糖，0.05 g酸水解酪素，0.03 g丙酮酸鈉，1.5 g瓊脂粉，100 mL海水，pH 6.8。

R2A培養(yǎng)基（純水）：0.05 g細菌學(xué)蛋白胨，0.05 g酵母粉，0.05 g可溶性淀粉，0.05 g葡萄糖，0.05 g 酸水解酪素，0.03 g丙酮酸鈉，1.5 g瓊脂粉，100 mL純水，pH 6.8。

R2A培養(yǎng)基（NaCl）：0.05 g細菌學(xué)蛋白胨，0.05 g酵母粉，0.05 g可溶性淀粉，0.05 g葡萄糖，0.05 g 酸水解酪素，0.03 g丙酮酸鈉，1.5 g瓊脂粉，100 mL 2%NaCl溶液，pH 6.8。

1.1.2 待測菌株

HB10001，HB10303分離自海南省三亞市三亞灣海水和海南省昌江縣海泥（表1）。

1.2 方法

1.2.1 海水、海綿、海泥樣品采集

于2011年9～10月分別在海南省和廣東省采集樣品用于海洋微生物分離。樣品信息詳見表1。

1.2.2 依賴海水細菌的分離方法

將采回的海綿、海底沉積泥樣品加入一定比例的無菌海水，勻漿后，備用。配制R2A海水和R2A純水平板培養(yǎng)基。將處理好的樣品稀釋至10-3涂布在R2A海水平板上，培養(yǎng)7 d后，首先進行菌落形態(tài)和菌落個數(shù)統(tǒng)計，然后將R2A海水平板上長出的可見菌落挑出在新的R2A海水平板培養(yǎng)基上重新劃線培養(yǎng)，以獲得純菌株。再將獲得的純菌株進行進一步的海水需求試驗。

1.2.3 海水需求試驗

純化后的細菌測定步驟：用滅菌接種環(huán)從R2A（海水）培養(yǎng)基上挑取一定量的菌落，分別接種于R2A（純水），R2A（海水）以及R2A（NaCl）3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～4周。采用顯微鏡觀察其生長情況。如果只在海水R2A培養(yǎng)基中觀察到菌落生長，則說明其需要海水才能正常生長。

統(tǒng)計R2A（純水），R2A（海水）以及R2A（NaCl）平板培養(yǎng)基分離海水、海綿樣品的菌落數(shù)；統(tǒng)計海水需求試驗結(jié)果，記錄嚴格依賴海水和不需要依賴海水的菌株數(shù)，并統(tǒng)計其在總體分離細菌中所占比例。將嚴格需求海水的細菌作為目標(biāo)菌，進行下一步測序研究。

1.2.4 培養(yǎng)特征分析

采用R2A（海水）培養(yǎng)基，將純化的于對數(shù)生長期的成熟菌株HB10001，重新接種在R2A（海水）培養(yǎng)基上，于25℃溫箱中培養(yǎng)7～14 d，并觀察記錄菌落形態(tài)、大小、干濕情況、顏色特征和生長狀況等。

1.2.5 顯微形態(tài)特征分析

將接種純化后的待測菌培養(yǎng)7～14 d后，選取生長較好的菌落，用滅菌接種環(huán)將菌落挑取到無菌離心管中，冷凍干燥。再將凍干呈粉狀的待測菌貼于有導(dǎo)電膠帶的電鏡樣品底座上，鍍膜處理（純金膜）。最后采用掃描電鏡觀察，并選取較好的待測菌密度以及清晰的視野進行拍照保存。

1.2.6 生理特征分析

均參考Smibert和Krieg[6]的方法，包括革蘭氏染色，菌株運動性試驗，耐鹽范圍，生長pH值范圍，生長溫度范圍。

1.2.7 分子分類研究

總DNA提取、16S rDNA基因擴增與系統(tǒng)發(fā)育分析：采用Saito和Miura[7]報道的方法提取和純化細菌DNA。PCR擴增條件：93℃、預(yù)變性2 min；再于93℃變性30 s，52℃退火60 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)：72℃ 延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物電泳檢測。將PCR擴增產(chǎn)物交給上海生工工程有限公司測序后，獲得的菌株16S rDNA序列，通過GenBank中的Blast程序與核酸數(shù)據(jù)進行對比，分析得出相似性（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）[8]。選取系統(tǒng)中比對結(jié)果相似性高的菌株及其序列，采用Clustal X2.0軟件包進行多序列匹配排列，Mega3.1軟件包中的Kimura-parameter 方法計算進化距離，neighbor-joining[9]方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，100次隨機抽樣，以自引導(dǎo)值（Bootstrap）評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度[10]。

（G+C）mol%含量的測定：采用Mesbah報道的方法，用高效液相色譜分析基因組DNA（G+C）mol%[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 依賴海水細菌的分離培養(yǎng)

2.1.1 菌落計數(shù)

在稀釋梯度為10-3的情況下，通過平板計數(shù)發(fā)現(xiàn)，R2A海水培養(yǎng)基，無論是在菌落形態(tài)多樣性上，還是菌落個數(shù)的統(tǒng)計上，都較其他2種培養(yǎng)基更優(yōu)（圖1，表2）。結(jié)果表明，R2A海水培養(yǎng)基上的菌落直徑在0.2～2 mm，形狀以圓形為主，邊緣規(guī)則，顏色以白色和透明無色為主，有黃色，藍色和綠色的菌落。

2.1.2 海水需求實驗

結(jié)果表明，經(jīng)過劃線純化后的267株細菌中，有9株嚴格依賴海水的細菌（圖2），編號分別為：HB09009，HB09010，HB09012，HB10001，HB10301，HB10302，HB10303，HB10304，HB10305。觀察菌株HB10001、HB10303在海水、純水及NaCl 3種R2A培養(yǎng)基上的生長狀況發(fā)現(xiàn)：HB10001、HB10303在最適溫度25℃下，經(jīng)過1～4周培養(yǎng)，HB10001在純水及2% NaCl的R2A培養(yǎng)基上無生長，只在海水R2A培養(yǎng)基上生長，且生長狀況良好；HB10303僅能在海水R2A培養(yǎng)基上生長，且生長狀況不好，說明培養(yǎng)基有待進一步優(yōu)化。

2.2 菌株HB10001和HB10303的鑒定

2.2.1 培養(yǎng)特征分析

菌株HB10001培養(yǎng)特征：生長緩慢，在R2A固體培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)6 d左右可見菌落，培養(yǎng)10 d左右可見成熟、清晰的菌落形態(tài)為扁平的圓形小菌落，菌落直徑為0.1～0.3 mm；菌落成乳黃色、半透明、表面光滑、邊沿不規(guī)則，無基內(nèi)菌絲。

菌株HB10303培養(yǎng)特征：生長緩慢，在R2A固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)10～15 d可見菌落，培養(yǎng)20 d以上可見成熟、清晰的菌落形態(tài)為扁平的圓形小菌落，直徑為0.5 mm；菌落呈白色半透明狀，表面光滑，邊沿規(guī)則，無基內(nèi)菌絲 。

2.2.2 顯微形態(tài)特征分析

菌株HB10001顯微形態(tài)特征：兩頭尖的長桿狀，不產(chǎn)生孢子，無鞭毛。大小范圍：長徑為100～300 μm，短徑為10 μm。

菌株HB10303顯微形態(tài)特征：長桿狀。大小范圍：短徑0.5～1.4 μm，長徑2～8 μm（圖3）。

2.3 生理特征

菌株HB10001為革蘭氏陰性細菌，無運動性。在海水存在的情況下，能在0～4% NaCl范圍內(nèi)生長，最適為3%。能在pH值5.5～7.5的范圍內(nèi)生長，最適pH 6.8。能在溫度為8～38℃的范圍內(nèi)生長，最適生長溫度為25～38℃。

菌株HB10303為革蘭氏陰性細菌，無運動性。在海水存在的情況下，能在0～3% NaCl范圍內(nèi)生長，最適為1%。能在pH值5.5～7.5的范圍內(nèi)生長，最適pH 7.2。能在溫度為8～45℃的范圍內(nèi)生長，最適生長溫度為15℃。

2.4 分子指征分析

2.4.1 基因組DNA（G+C）mol%含量

對2株新分離的菌落進行（G+C）mol%含量分析發(fā)現(xiàn)，菌株HB10001的（G+C）mol%為66.7%，菌株HB10303的（G+C）mol%為45.5%。

2.4.2 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株HB10001和菌株HB10303 16S rDNA序列全長分別為1 424 、1459 bp，將16S rDNA序列拼接后的結(jié)果與EzTaxon server（http：//www.eztaxon.org/）（Chun et al.，2007）中相關(guān)菌進行Blast比對，并將該結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫中進行登陸注冊，菌株HB10001的登錄號為HM068370。參照序列比對后的結(jié)果，選取同源性高的標(biāo)準(zhǔn)菌株，利用ClustalX（Version1.8）軟件進行排序，選用Mega 3.1軟件中的neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4、5）

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)今有關(guān)真正的海洋微生物的定義仍有爭論，普遍認為，分離自海洋環(huán)境，正常生長需要海水，并可在寡營養(yǎng)、低溫條件下生長的微生物可視為嚴格的海洋微生物。然而，有些分離自海洋的微生物，其生長不一定需要海水，只需要加入適當(dāng)?shù)柠}離子，就可產(chǎn)生不同于陸棲微生物的代謝產(chǎn)物，或者擁有某些特殊的生理性質(zhì)，也被視為海洋微生物。與陸棲細菌相比，海洋細菌普遍耐鹽，最適鹽度在2%～4%，也可以利用海洋微生物的特殊耐鹽度篩選真正的海洋細菌。本研究采用的分離依賴海水細菌的方法，是用于篩選出嚴格需求海水的細菌。此類細菌在普通的淡水寡營養(yǎng)培養(yǎng)基或者加入一定量Na+的情況下，都不能正常生長。本研究發(fā)現(xiàn)，在傳統(tǒng)的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基中，添加海水可提高海洋微生物的可培養(yǎng)性。所獲得的9株菌則是常規(guī)傳統(tǒng)培養(yǎng)基分離所忽略的類群。

細菌的多相分類研究經(jīng)歷了長期不斷的發(fā)展和提高。早期主要以形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征等分類學(xué)特征對其進行描述分類。但傳統(tǒng)分類系統(tǒng)不能確切說明遺傳進化地位和關(guān)系?，F(xiàn)今分子生物學(xué)技術(shù)在現(xiàn)代分類學(xué)中已占主導(dǎo)地位。一般認為，16S rDNA 序列同源性大于95%的菌可歸為同一屬，大于97% 可視為同一種。因此，在菌株鑒定時，16S rDNA 序列同源性低于 95%的菌可考慮建立新屬，低于 97% 的建立新種時必須測定DNA-DNA 雜交率。本實驗得到的菌株HB10001，與其16S rDNA序列同源性最高的是Spongiibacter tropicus DSM19543T（96.3%），因此需要測定 DNA-DNA 雜交率來確定是否為新種。HB10303與Paenibacillus. agaridevorans DSM1355T（98.4%）的16S rDNA序列同源性最高，則需要通過進一步的多相分類來鑒定。

同時，菌株HB10001、HB10303分離自中國南海，都只能在海水培養(yǎng)基中形成正常的菌落，離開海水，均不能生長。此外，通過耐鹽試驗發(fā)現(xiàn)，HB10001耐鹽范圍為0～4%，HB10303耐鹽范圍為0～3%。綜合菌株來源、低溫適應(yīng)性、菌株嚴格依賴海水生長、鹽耐受性，認為菌株HB10001，HB10303為海洋細菌。

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