劉小玲+陳曉明+阮晨+許燕+王+超+廖祥兵+宋收+羅學剛

摘 要 為了消除微生物培養(yǎng)基對U（Ⅵ）和U（Ⅳ）質量濃度測定的影響，建立微生物培養(yǎng)基中測定U（Ⅵ）和U（Ⅳ）質量濃度ρ的方法，優(yōu)化了在稀鹽酸體系中利用U（Ⅵ）制備U（Ⅳ）的條件：10 mg/L U（Ⅵ），鋅粒用量12 g/L，反應時間180 min.通過測定ρ總U減去ρU（Ⅵ），計算出ρU（Ⅳ），建立了同時測量微生物培養(yǎng)基中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ）的分光光度法.微生物培養(yǎng)基對U（Ⅵ）和U（Ⅳ）有明顯影響：LB和NA培養(yǎng)基對U（Ⅵ）的影響率分別為37.3%和47.9%；單組分中蛋白胨和牛肉膏對U（Ⅵ）的影響率較大，分別達到33.5%和19.7%；而U（Ⅵ）和U（Ⅳ）在TGY培養(yǎng)基中較穩(wěn)定.采用該方法測量微生物培養(yǎng)基中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ），能消除微生物培養(yǎng)基對U的影響，且具有精密度高、操作簡單等優(yōu)點，能實現(xiàn)生物樣品中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ）的快速測量.

關鍵詞 U（Ⅳ）的制備；分光光度法；微生物培養(yǎng)基；U穩(wěn)定性

中圖分類號 O614.62 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2537（2015）03-0022-07

隨著核工業(yè)的發(fā)展，含U放射性廢物不斷進入環(huán)境中，對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成威脅.地殼表層平均鈾含量為3 μg/g[1].鈾礦冶、核電站、核武器實驗等含鈾廢水中，鈾的質量濃度約為5 mg/L，遠高于國家排放標準（0.05 mg/L），也遠高于世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定飲用水標準最高鈾質量濃度50 μg/L [2-3].高濃度鈾的放射性和化學毒性影響動物和人體腎臟和骨骼的正常功能[4]，因此，U污染的環(huán)境修復問題已成為當前的研究熱點.據(jù)報道微生物修復U污染比物理化學修復更具有顯著優(yōu)勢[5].自然環(huán)境中，U有Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ 4種價態(tài)，U（Ⅲ）和U（V）不穩(wěn)定，極易歧化，因此U（Ⅵ）和 U（Ⅳ）是兩種最主要的價態(tài)[6].

因U易受環(huán)境中pH值、有機物、氧化還原條件等的影響，其化學形態(tài)在實際環(huán)境體系中可互相轉化，增加了U價態(tài)分析的難度.

目前，微生物培養(yǎng)基中U（Ⅵ）和 U（Ⅳ）的測量方法為偶氮胂（Ⅲ）分光光度法[7-8].其原理是U（Ⅵ）和 U（Ⅳ）在酸性條件下與偶氮胂（Ⅲ）形成1∶1絡合物，在特定波長處測其吸光度[9-10].但偶氮胂（Ⅲ）分光光度法在U（Ⅵ）和U（Ⅳ）質量濃度的測量過程中，忽略了微生物培養(yǎng)基對U的影響及U（Ⅳ）的不穩(wěn)定性，而不能同時準確測量其中U（Ⅳ）的質量濃度.因此，為了深入研究微生物對U的氧化還原作用，有必要在微生物培養(yǎng)基中建立一種能同時測量U（Ⅵ）和U（Ⅳ）質量濃度的方法.

通過將U的多形態(tài)分析轉為單一形態(tài)分析，即運用分光光度法，通過U的氧化還原，測量體系中U（Ⅵ）和總U的質量濃度ρ，ρ總U減去ρU（Ⅵ）得出ρU（Ⅳ），可消除培養(yǎng)基中U（Ⅳ）不穩(wěn)定性及微生物培養(yǎng)基對其影響問題.U（Ⅳ）作為U（Ⅵ）的還原產(chǎn)物，也是氧化還原過程中的反應試劑，其制備方法包括還原劑還原法（金屬還原劑、汞齊及合金還原劑、低價金屬化合物）、電化學法、光催化法等[11].其中部分還原方法操作復雜、易受還原劑、催化劑及反應條件等的限制.因此需尋找一種操作過程簡單、不易引入干擾物質，避免在HCl、HF、稀H2SO4、低濃度HClO4中U（Ⅵ）還原產(chǎn)物U（Ⅳ）的再氧化作用的U（Ⅳ）制備方法；再運用U的氧化還原過程建立U（Ⅵ）和U（Ⅳ）的分光光度法；通過該方法研究U（Ⅵ）和U（Ⅳ）在微生物培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性，為微生物固定U（Ⅵ）選用適合的培養(yǎng)基提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

TGY培養(yǎng)基（胰蛋白胨酵母葡萄糖培養(yǎng)基）：胰蛋白胨5 g，酵母粉3 g，葡萄糖1 g，定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2.

LB培養(yǎng)基（溶菌肉湯培養(yǎng)基）：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，定容至1 000 mL，pH 7.2～7.4.

NA培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，定容至1 000 mL，pH 7.0.

1 000 mg/L U（Ⅵ）標準儲備液：1.782 2 g醋酸雙氧U（UO2（CH3COO）2·H2O上海譜振生物科技有限公司），溶解并定容至1 000 mL，搖勻，避光保存，其他各濃度U（Ⅵ）由此溶液稀釋獲得.

0.05%偶氮胂（Ⅲ）顯色液（上海阿拉?。号嫉希á螅?.05 g，定容至100 mL.

無砷鋅粒（成都市科龍化工試劑廠）.其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 U（Ⅵ）標準曲線的制作

取1 000 mg/L U（Ⅵ） 2 mL，去離子水定容至50 mL，配制成40 mg/L U（Ⅵ），8支10 mL比色管，分別加入40 mg/L U（Ⅵ）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2 mL，0.05%偶氮胂Ⅲ1 mL，緩沖液定容至10 mL，充分搖勻，靜置30 min，于652 nm處測其吸光度.

1.3 U（Ⅳ）的制備方法優(yōu)化

在6 mol/L HCl介質中，以鋅粒為還原劑，考察U（Ⅵ）初始濃度、鋅粒用量、反應時間等對U（Ⅳ）制備的影響，得出優(yōu)化條件[12].最后測量溶液殘留U（Ⅵ），考察U（Ⅳ）的生成率.

U（Ⅵ）的生成率（%）=ρ1-ρ2ρ1×100%，（1）

式中ρ1為U（Ⅵ）起點質量濃度，mg/L；ρ2為U（Ⅵ）殘留質量濃度，mg/L.

1.3.1 初始U（Ⅵ）質量濃度對U（Ⅳ）制備的影響 分別取1 000 mg/L U（Ⅵ） 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL于50 mL容量瓶中，加入6 mol/L HCl 45 mL，加入鋅粒0.6 g，使其用量為12 g/L，定容.U（Ⅵ）最終分別為4，6，8，10，12，14，16，18，20 mg/L.

1.3.2 鋅粒用量對U（Ⅳ）制備的影響 取1 000 mg/L U（Ⅵ） 0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入6 mol/L HCl 45 mL，加入鋅粒分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 g，定容.使鋅粒用量分別為4，8，12，16，20，24，28，32，36 g/L.

1.3.3 反應時間對U（Ⅳ）制備的影響 取1 000 mg/L U（Ⅵ） 0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入6 mol/L HCl 45 mL，加入鋅粒使其用量為12 g/L，反應時間分別為90，120，150，180，210 min，定容.

1.4 微生物培養(yǎng)基中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ）測試方法的建立

1.4.1 微生物培養(yǎng)基中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ）分光光度法的建立 微生物培養(yǎng)基中U（Ⅳ）由于易受溫度、空氣中氣體、體系中酸性介質等影響發(fā)生氧化，造成形態(tài)發(fā)生變化.在U（Ⅵ）和U（Ⅳ）的微生物培養(yǎng)基混合體系中，運用偶氮胂（Ⅲ）分光光度法先測量樣品中ρU（Ⅵ），另取樣品將U（Ⅳ）氧化成總U，利用ρ總U減去ρU（Ⅵ）得出ρU（Ⅳ），即整個研究過程中通過ρU（Ⅵ）和ρ總U定量ρU（Ⅳ），使多組分分析轉換成單組分分析.該方法解決了微生物培養(yǎng)基對U的影響及U（Ⅳ）的不穩(wěn)定性問題，能同時測量微生物培養(yǎng)基中ρU（Ⅵ）和ρU（Ⅳ）.

偶氮胂（Ⅲ）分光光度法測試ρU（Ⅵ）：取2 mL樣品，1 mL 0.05%偶氮胂（Ⅲ）顯色液，0.4 mol/L氯乙酸-0.4 mol/L氯乙酸鈉緩沖液定容至10 mL，靜置30 min，波長652 nm處測量其吸光度；偶氮胂（Ⅲ）分光光度法測試ρU（Ⅳ）則先測試樣品中ρU（Ⅵ），另取2 mL樣品采用1 mL濃硝酸加熱趕酸，保持微沸狀態(tài)，直到出現(xiàn)白色殘渣為止，溶解并定容至5 mL.用偶氮胂（Ⅲ）分光光度法測試ρU（Ⅵ），此為ρ總U.含U混合體系中ρU（Ⅳ）由兩者的差值得出.ρU（Ⅳ）按式（2）計算：

ρU（Ⅳ）=ρ總U-ρU（Ⅵ）.（2）

式中 ρU（Ⅳ）為U（Ⅳ）質量濃度，mg/L；ρ總U為總U質量濃度，mg/L；ρU（Ⅵ） 為U（Ⅵ）質量濃度，mg/L.

1.4.2 濃硝酸用量對U（Ⅳ）氧化率的影響 取10 mg/L U（Ⅳ）25 mL于容量瓶中，TGY培養(yǎng)基定容至50 mL.分別加入0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL濃硝酸對2 mL培養(yǎng)基中的U（Ⅳ）進行氧化，反應完成后偶氮胂（Ⅲ）分光光度法測量ρU（Ⅵ），即ρ總U.考察濃硝酸用量對U（Ⅳ）氧化率的影響，U（Ⅳ）的氧化率按式（3）計算：

氧化率（%）U（Ⅳ）=ρU（Ⅵ）ρ總U×100%.（3）

式中ρU（Ⅵ）為U（Ⅵ）質量濃度，mg/L；ρ總U為總U質量濃度，mg/L.

1.5 U在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性研究

1.5.1 U（Ⅵ）在TGY，LB，NA培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性研究 取過濾除菌1 000 mg/L U（Ⅵ） 1 mL，分別加入至已滅菌的99 mL NA，LB，TGY的液體培養(yǎng)基中，得到最終10 mg/L U（Ⅵ）.30 ℃，120 r/min，震蕩60 h，間隔12 h 取樣，測量微生物培養(yǎng)基對U（Ⅵ）的影響率.微生物培養(yǎng)基對U（Ⅵ）的影響率按式（4）計算：

影響率（%）=ρ1-ρ2ρ1×100%.（4）

式中ρ1為U（Ⅵ）起點質量濃度，mg/L；ρ2為U（Ⅵ）殘留質量濃度，mg/L.

1.5.2 培養(yǎng)基單組分對U（Ⅵ）穩(wěn)定性的影響 按單組分在微生物培養(yǎng)基中的比例，即3 g/L酵母粉，10 g/L 蛋白胨，3 g/L牛肉膏，5 g/L胰蛋白胨，1 g/L葡萄糖，10 g/L氯化鈉的液體培養(yǎng)基中加入過濾除菌的1 000 mg/L U（Ⅵ） 1 mL，得到最終10 mg/L U（Ⅵ）.30 ℃，120 r/min，震蕩60 h，間隔12 h取樣，考察培養(yǎng)基單組分對U（Ⅵ）的影響.

1.5.3 U（Ⅳ）在TGY培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性研究 等體積混合過濾除菌的10 mg/L U（Ⅳ）與滅菌TGY培養(yǎng)基， 30 ℃，120 r/min，震蕩60 h，間隔12 h取樣.含U混合體系中，測量2 mL樣品中ρU（Ⅵ），另取2 mL樣品加入1 mL濃硝酸將其中U（Ⅳ）硝化為總U，測ρ總U，ρU（Ⅵ），計算出ρU（Ⅳ），考察TGY培養(yǎng)基中U（Ⅳ）的穩(wěn)定性.

2 結果與討論

2.1 U（Ⅵ）標準曲線的制作

以U（Ⅵ）質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，擬合后得到U（Ⅵ）標準曲線，結果如圖1所示.可知標準曲線方程y=0.040x-0.007，R2=0.999，在ρU=0.0～20.0 mg/L范圍內，吸光度-ρU關系符合比爾定律.

2.2 U（Ⅳ）的制備方法優(yōu)化

2.2.1 ρU（Ⅵ）對U（Ⅳ）制備的影響 保持反應體系中的ρU（Ⅵ）分別為4，6，8，10，12，14，16，18，20 mg/L，HCl濃度6 mol/L，鋅粒12 g/L，總反應體積為50 mL.U（Ⅳ）生成率隨U（Ⅵ）初始濃度的變化見圖2.由圖2可知，在4～10 mg/L U（Ⅵ）終濃度范圍內，U（Ⅳ）生成率隨著ρU（Ⅵ）的增大保持穩(wěn)定狀態(tài)，達到95%左右.但ρU（Ⅵ）為10～20 mg/L時，U（Ⅳ）生成率隨著ρU（Ⅵ）的增加，生成率急劇下降.因此，選擇最適ρU（Ⅵ）為10 mg/L.

2.2.2 鋅粒用量對U（Ⅳ）制備的影響 保持反應體系中的ρU（Ⅵ）為10 mg/L，HCl濃度為6 mol/L，總反應體積為50 mL，反應體系中的鋅粒用量分別為4，8，12，16，20，24，28，32，36 g/L.U（Ⅳ）生成率隨鋅粒用量的變化見圖3.由圖3可知，鋅粒用量在4～12 g/L范圍內，U（Ⅳ）生成率隨著鋅粒濃度的增加而增大.當鋅粒用量為12 g/L時，生成率達到最大.但當鋅粒用量大于28 g/L時，生成率呈明顯減小趨勢，且有典型的黑色絮狀沉淀.推測鋅粒過量時，會對ρU（Ⅵ）的測量有較大影響.因此選擇最適宜鋅粒用量為12 g/L.