李正華　王倩　白卉

摘要[目的]優(yōu)化白樺樹皮樺木醇含量高效液相檢測方法。[方法]利用均勻試驗(yàn)設(shè)計篩選了白樺待分析樣品的制備方法，測定了距地面不同高度位置白樺樹皮中樺木醇的含量。[結(jié)果]在0.5～4.0 m高度范圍內(nèi)，距地面1.5 m處的白樺樹皮中樺木醇的含量最高，為17.56%，距地面4.0 m處的白樺樹皮中樺木醇的含量最低，為14.51%。整體上，不同高度位置的白樺樹皮中樺木醇含量差異不顯著。[結(jié)論]得到提取樺木醇樣品制備的最佳條件：以100%乙醇70 ℃超聲波（40 Hz， 150 W）提取白樺樹皮樣品60 min。

關(guān)鍵詞白樺；樺木醇；超聲波輔助提取；均勻設(shè)計；高效液相

中圖分類號S792.153文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）07-162-02

Optimization of Determination of Betulin in Betula platyphylla Bark by HPLC

LI Zheng-hua1， WANG Qian2， BAI Hui1*

（1.Key Laboratory of Fast-growing Tree Cultivating， Forestry Research Institute of Heilongjiang Province，Harbin，Heilongjiang 150081； 2.Heilongjiang ZBD Pharmaceutical Company Ltd，Harbin，Heilongjiang 150060）

Abstract[Objective] The determination of betulin in Betula platyphylla bark by HPLC was optimized. [Method] Using uniform design， betulin content in Betula platyphylla bark at different height above ground was determined. [Result] The result showed that the betulin content was the highest of 17.56% at the height of 1.5 m ， and the lowest was 14.51% at the height of 4.0 m within the range of 0.5-4.0 m above ground， but there was no significant difference among different positions. [Conclusion] The optimal conditions for betulin extraction were explored to be ultrasonically extracted by absolute alcohol at 70 ℃ （40 Hz， 150 W） for 60 min.

Key words Betula platyphylla；Betulin；Ultrasonic extraction method；Uniform design；High-performance liquid chromatography

白樺（Betula platyphylla）是樺木科樺木屬落葉喬木，在我國分布廣泛[1]，尤其在東北地區(qū)白樺林約占東北森林總面積的20%，且多為純林。白樺是我國北方的主要造林和工業(yè)用材樹種，是黑龍江省重要的林木資源[2]。在白樺采伐和加工過程中，會產(chǎn)生樹皮、枝椏、樹梢等大量剩余物。在這些白樺樹皮等剩余物中含有一種重要的五環(huán)三萜次生代謝產(chǎn)物——樺木醇，又名樺木腦、白樺酯醇[3]。該物質(zhì)無毒，具有抗腫瘤、消炎、快速治愈傷口、抗過敏等功效，在食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[4-5]。還有研究表明樺木醇衍生物在艾滋病和癌癥治療方面亦具有巨大的潛能[6]，因此對工業(yè)用材的樺樹皮等剩余物進(jìn)行有效利用，將會產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益。

樺木醇在白樺樹皮中含量為15%～35%，樺木醇主要是以晶狀沉積物的形式存在于樹皮外層，且在不同部位含量差異顯著，含量分布依次為：外皮含量>枝皮含量>內(nèi)皮含量>芽含量>葉含量>根含量>花粉含量[7]。目前關(guān)于樺木醇的制備方法及含量的測定已有報道[8-9]，但采用這些方法前需要減壓高溫或用有毒性的有機(jī)溶劑進(jìn)行預(yù)處理，操作時間長，對環(huán)境危害大，而關(guān)于樺木醇提取方法的研究較少。

超聲波是一種彈性波，它能產(chǎn)生并傳遞強(qiáng)大的能量，產(chǎn)生空化作用，使植物細(xì)胞破裂。超聲波輔助提取法是將原料保存于提取液體系中用1次超聲波提取以獲得待分析樣品的技術(shù)方法。與常規(guī)提取法相比，超聲波輔助提取法具有提取時間短、產(chǎn)率高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，更適合樣品的快速測試[10]。該研究在確定樺木醇高效液相色譜分析條件的基礎(chǔ)上，運(yùn)用均勻設(shè)計方法考察了乙醇濃度、提取時間、提取溫度和超聲波功率對白樺樹皮中樺木醇超聲波提取效果的影響，確定了用于測定樺木醇含量的白樺樹皮樣品的提取方法，建立了一種簡單、快捷、準(zhǔn)確的白樺樹皮中樺木醇含量的測定方法，并對不同高度白樺樹皮中樺木醇的含量進(jìn)行了分析，為工業(yè)化提取樺木醇制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白樺樹皮于2013年5月采自黑龍江省牡丹江市林口縣青山林場，選擇干型通直、生長一致、無機(jī)械損傷的白樺成樹4株，分別在樹高0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 m處取10 cm×10 cm大小的樹皮，80 ℃下烘干48 h后粉碎，取平均粒徑3 mm白樺皮粉末備用。

試劑：乙腈為色譜純，水為自制超純水，其他試劑均為分析純。樺木醇標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters高效液相色譜儀（2487型雙波長紫外檢測器，美國Waters）；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)（美國Beckmann）；萬分之一電子天平（德國Sartorius）；AS20500A型超聲清洗器（天津Auto science）。

1.3 色譜條件

色譜柱：美國Thermo Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：室溫；流動相：乙腈/水（體積比8/2）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的繪制

精密稱取樺木醇標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，無水乙醇定容至10 ml，作為母液。

吸取母液0.2、0.5、1.0、1.5 ml于2 ml容量瓶中，以無水乙醇定容至刻度、搖勻。按照

“1.3色譜條件”，分別對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測定3次。以樺木醇的質(zhì)量濃度（mg/ml）x為橫坐標(biāo)、峰面積值y為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計算，得回歸方程y=7 315 959.835 2 x+71 574.642 9，相關(guān)系數(shù)R=0.998 7，線性范圍：0.2～2.0 mg/ml。

1.5樣品制備

影響植物中有效成分超聲波提取得率的因素主要有提取溶劑、超聲波功率、提取時間、提取溫度等[11]。該研究選擇了乙醇濃度、提取溫度、提取時間和超聲波功率進(jìn)行4因素10水平的均勻設(shè)計試驗(yàn)（表1），以樺木醇的提取率為評價指標(biāo)，探討了超聲波輔助提取白樺樹皮中樺木醇的最佳條件。

精密稱取干燥粉碎后0.1 g白樺樹皮樣品于25 ml容量瓶中，按照設(shè)計的試驗(yàn)條件，分別加入不同濃度的乙醇24 ml（重復(fù)3次），在相應(yīng)的提取條件下提取，冷卻至室溫后用相應(yīng)濃度的乙醇定容至刻度，靜置后移取1 ml上清液至離心管中，離心（12 500 g）10 min，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析

按上述試驗(yàn)條件對白樺樹皮提取液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，得到它們的色譜分離結(jié)果（圖1）。樺木醇的保留效果較好，達(dá)到基線分離，分析出峰時間較短，專屬性好，有利于快速分析。

圖1標(biāo)準(zhǔn)品（A）和樣品（B）的色譜分離結(jié)果

2.2樣品制備條件的確定

均勻設(shè)計試驗(yàn)結(jié)果見表1。分別以乙醇濃度（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）和超聲波功率（X4）為自變量，以樺木醇提取率（Y）為因變量，應(yīng)用均勻設(shè)計應(yīng)用軟件（3.0版）數(shù)據(jù)處理軟件對設(shè)計結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得回歸方程如下：

Y=8.284 076 4-0.101 362 6X1+0.000 392 4X22+0.000 443 7X32-0.000 093 1X3X4，R=0.917 6

根據(jù)回歸方程計算得出選定的試驗(yàn)條件范圍內(nèi)超聲波提取樺木醇的最佳提取條件為100%乙醇，70 ℃，超聲波功率150 W，提取60 min。

表1U*10（104）均勻設(shè)計試驗(yàn)條件及分析結(jié)果

2.3精密度試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液每次進(jìn)樣20 μl，重復(fù)測定5次，樺木醇標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積積分值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.38%。

2.4回收率試驗(yàn)

精密稱取3份白樺樹皮粉末，每份0.05 g，分別精密加入樺木醇標(biāo)準(zhǔn)溶液4.67 ml，按樣品制備及測定方法進(jìn)行定量分析，測得樺木醇加樣回收率和RSD分別為97.60%、1.82%。

2.5不同高度白樺樹皮中樺木醇含量測定

分析不同高度白樺樹皮中樺木醇的含量，結(jié)果表明在距地面0.5～4.0 m高度的白樺樹皮中均含有樺木醇，1.5 m處的白樺樹皮中樺木醇的含量最高，為17.56%，4.0 m處的白樺樹皮中樺木醇的含量最低，為14.51%。整體上，各高度處的樺木醇含量差異不顯著（表2）。

表2不同高度白樺樹皮中樺木醇的含量

取樣高度∥m樺木醇含量∥%取樣高度∥m樺木醇含量∥%

0.516.15±2.922.515.64±1.75

1.017.16±3.813.014.64±2.36

1.517.56±2.713.515.69±3.47

2.015.33±1.764.014.51±3.68

3 結(jié)論與討論

（1）白樺樹皮含有15%～35%的樺木醇，在白樺木材加工過程中可產(chǎn)生大量白樺樹皮剩余物，能夠作為樺木醇的較好來源，有利于樺木醇的研究和利用。建立一種高效便捷的白樺樹皮中樺木醇分析方法，對研究和利用樺木醇這一次生代謝產(chǎn)物具有較大意義。該試驗(yàn)運(yùn)用均勻設(shè)計法考察了白樺樹皮中樺木醇的超聲波提取試驗(yàn)條件，得到提取樺木醇樣品制備的最佳條件：以100%乙醇70 ℃超聲波（40 Hz，150 W）提取白樺樹皮樣品60 min。

（2）采用上述方法分析不同高度白樺樹皮中樺木醇的含量，結(jié)果表明在0.5～4.0 m高度的白樺樹皮中均含樺木醇，樺木醇含量在14.51%～17.56%之間，其含量差異不顯著。整體上，白樺下部樹皮樺木醇含量高于上部，即老樹皮含量高于新樹皮，樺木醇含量高低可能與沉積的時間長短密切有關(guān)。

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