陳健　張東玲　葉坤等

摘要[目的] 為進一步研究大黃魚抗刺激隱核蟲的免疫防御奠定基礎，也為海水魚類養(yǎng)殖的免疫預防提供參考。[方法] 用孵化2 h內的刺激隱核蟲感染大黃魚，并運用Real-time PCR檢測MHC IIB基因在各組織（鰓、皮膚、脾和頭腎）中表達量的變化。[結果] MHC IIB基因在鰓、皮膚和脾臟中的表達水平呈現(xiàn)先上調后逐漸下降的趨勢，在感染6和12 h后表達量顯著升高（P<0.05）；在頭腎中，MHC IIB基因在感染后6 和12 h的表達量顯著下調（P<0.05），在感染2 d后顯著上升（P<0.05）。[結論] 大黃魚MHC IIB基因在刺激隱核蟲的免疫應答過程中可能發(fā)揮重要作用。

關鍵詞大黃魚；MHC IIB；刺激隱核蟲

中圖分類號S965.322文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）07-143-04

主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）是目前已知存在于所有脊椎動物體內與機體免疫機能密切相關的基因群[1-2]。最常見的MHC主要由2類分子組成：MHC I和MHC II類。MHC I類分子負責將內源性抗原呈遞給CD8+ T細胞，MHC II類分子則將外源性抗原呈遞給CD4+細胞[3-4]。MHC II類分子由α鏈和β鏈組成，其中MHC IIB基因編碼β鏈區(qū)域，是研究最為廣泛的一類MHC II分子[5-6]。近年來，已有多種魚類的MHC IIB基因被克隆和鑒定，如虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[7-9]、真鯛（Pagrus major）[10]、鮸魚（Miichthys miiuy）[11]、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[12]、大菱鲆（Turbot）[13]、草魚（Grass carp）[14]、建鋰[15]（Cyprinus carpio var.jian）、鯉魚（Carp）[16-17]和斑馬魚（Zebrafish）[18-21]等，這些研究表明了MHC IIB基因的多態(tài)性和基因拷貝數(shù)目的差異性。MHC IIB基因或蛋白的組織分布和表達情況也有研究，在真鯛中MHC IIB基因在注射鰻弧菌后在肝、脾、頭腎和腸中的表達5～72 h明顯下降，96 h恢復[22]；在大菱鲆中MHC IIB基因在注射鰻弧菌后在肝和頭腎中的表達24～48 h呈下降趨勢，在脾中24～72 h顯著下降，96 h后在3個組織中的表達均上升[23]。前期的研究表明 MHC IIB基因參與由病毒和細菌所引起的魚類免疫應答，但對其是否參與魚類抗寄生蟲的免疫應答少有報道。

大黃魚（Larimichthys crocea）是我國主要養(yǎng)殖海水魚類之一。近年來，由于養(yǎng)殖密度過大和養(yǎng)殖環(huán)境惡化等原因，導致疾病頻頻暴發(fā)，嚴重威脅產業(yè)的發(fā)展。寄生蟲病害以刺激隱核蟲病引起的“白點病”最為嚴重，每年造成巨大的經濟損失。對于小水體養(yǎng)殖的刺激隱核蟲病，目前主要采取化學藥物治療[24]。對于網箱等開放養(yǎng)殖環(huán)境，一些物理方法和化學方法均起到一定效果，但它們都或多或少存在一些缺陷，如對魚有毒性、污染環(huán)境、效果不確定以及不適用于大水體等[25-26]。因此，有必要尋找一種切實可行、有效的防治方法。由于免疫預防的安全性、低成本和環(huán)保等優(yōu)勢，免疫防治刺激隱核蟲病目前被認為是一種相對有效的方法。筆者對感染刺激隱核蟲后MHC IIB基因在各組織（鰓、皮膚、脾、頭腎）中表達量的變化進行研究，探討MHC IIB基因在宿主對刺激隱核蟲免疫應答中發(fā)揮的作用，從分子角度初步揭示大黃魚抗寄生蟲的分子機制，為進一步系統(tǒng)研究大黃魚抗刺激隱核蟲的免疫防御奠定基礎，同時也為海水魚類養(yǎng)殖的免疫預防提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1

試驗材料。大黃魚：健康的大黃魚采自福建寧德養(yǎng)殖海區(qū)，體重（130 ±15） g；

刺激隱核蟲：以大黃魚為宿主，寧德海水試驗場傳代培養(yǎng)獲得幼蟲。

1.1.2

主要試劑。Trizol、RNA保存液（RNAfixer）、逆轉錄試劑盒（Promega GoscriptTM Reverse Transcription System）、熒光定量試劑盒（SuperReal PreMix Plus）等。

1.2方法

1.2.1

刺激隱核蟲感染大黃魚。分為試驗組和對照組，每組60條魚。試驗前將每組大黃魚在室內水泥池內馴養(yǎng)10 d，鹽度25‰～26‰。溫度25 ℃。室內馴養(yǎng)后，試驗組用剛孵化2 h內的刺激隱核蟲感染大黃魚，感染劑量為25 000幼蟲/尾[27]。由于刺激隱核蟲滋養(yǎng)體感染魚體后脫落，在池底形成包囊，3 d后孵化出幼蟲。為了避免重復感染，感染刺激隱核蟲的大黃魚3 d后移入新池。對照組除不給予刺激隱核蟲感染外，其他試驗方法均與試驗組一致。試驗組和對照組分別在首次感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d和5 d采集大黃魚皮膚、鰓、脾臟和頭腎（每個時間點每組取5尾魚）。

1.2.2

大黃魚組織總RNA的提取及cDNA鏈的合成。

采用Trizol分別提取大黃魚鰓、皮膚、脾臟和頭腎4個組織的總RNA，DNase I處理殘留 DNA 后，根據(jù)Promega GoscriptTM Reverse Transcription System說明書合成第一鏈cDNA。反轉錄PCR反應體系：RNA樣品4 μg，Oligo（dT）15 Primer 1 μl，Random Primer 1 μl，Nuclease-Free Water補至10 μl體系，70 ℃變性5 min，冰上放置5 min；再加入Nuclease-Free Water 1.5 μl，Goscript 5×Reaction Buffer 4 μl，MgCl2 2 μl，PCR Nucleotide Mix 1 μl，Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 μl，Goscript Reverse Transcriptase 1 μl，共10 μl體系?；靹蚝?，25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。合成后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3

大黃魚MHC IIB組織表達分析。根據(jù)大黃魚MHC IIB序列，設計特異引物（表1），以β-actin作為內參基因，通過RT-PCR分析大黃魚MHC II基因的表達模式。利用 LightCycler 480 熒光定量儀（Roche Sweden）進行實時熒光定量 PCR 反應。實時熒光定量PCR反應體系：2×SuperReal PreMix Plus 10.0 μl，引物F/R（10 μmol/L）0.6 μl，cDNA模板 8.4 μl，50×ROX Reference Dye 0.4 μl。實時熒光定量PCR反應程序：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 32 s，40個循環(huán)。利用Fold=2-ΔΔCT計算基因的相對表達量，然后用試驗組數(shù)值除以對照組數(shù)值得到試驗組相對于對照組的表達量，使用 SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件的 Duncans 檢驗法分析各組數(shù)據(jù)差異的顯著性。

表1所用引物序列

引物序列（5′ -3′） 目的

MHCII B QFCTGGCAGACGCTGATTGGTmRNA表達

MHCII B QRTCTCTCAGACTCAGGCAGGGAC

β-actin-FTTATGAAGGCTATGCCCTGCCmRNA表達

β-actin-RTGAAGGAGTAGCCACGCTCTGT

2 結果與分析

2.1熒光定量引物的特異性檢測

為了檢驗引物的特異性，反轉錄PCR擴增MHC IIB基因片段，PCR產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)其與預期目的基因片段（150 bp）大小一致（圖1），測序結果證實序列正確，說明設計合成的引物合格。

注：M. Marker 2000；1. MHC目的片段。

圖1 反轉錄PCR檢測MHC IIB熒光定量引物特異性

試驗組與對照組共8組不同檢測體系，以各自cDNA為模板，經過qRT-PCR檢測后得到擴增曲線（圖2a）和熔解曲線（圖2b）。分析發(fā)現(xiàn)，所得曲線均為單一峰，無非特異性擴增產物和引物二聚體產生，說明設計合成的引物特異性良好。

2.2刺激隱核蟲感染大黃魚誘導MHC IIB的表達分析

大黃魚受刺激隱核蟲感染后，通過qRT-PCR檢測大黃魚MHC IIB基因在4種組織（鰓、皮膚、脾和頭腎）中的表達水平。從圖3可以看出，在鰓組織中，受刺激隱核蟲感染后，試驗組大黃魚MHC IIB表達量在6和12 h顯著上升（P<0.05），分別為對照組的3.09倍和3.19倍。皮膚在感染12 h后MHC IIB基因的表達量顯著上升（P<0.05），其表達量為對照組的6.12倍；在感染3 d后MHC IIB基因的表達量顯著下調（P<0.05），其表達量僅為對照組的10.1%。

在脾臟，試驗組大黃魚MHC IIB基因的表達量在6和12 h顯著上升（P<0.05），分別為對照組的3.82倍和4.89倍，此后逐步恢復到對照組水平。頭腎在受刺激隱核蟲感染后，表達量開始下降，在6和12 h MHC IIB基因的表達量顯著下調（P<0.05），分別為對照組的61.9%和66.0%，感染2 d后MHC IIB基因的表達量顯著上升（P<0.05），其表達量為對照組的5.21倍。

3 討論

大黃魚鰓和皮膚是刺激隱核蟲感染的主要器官，也是魚類免疫防御的第一道屏障，而脾臟和頭腎是大黃魚重要的免疫器官[28]，因此選擇這4個部位來研究大黃魚在受刺激隱核蟲感染后MHC IIB基因的表達變化。在皮膚和鰓，在感染初期（6 h或12 h）MHC IIB的表達量顯著升高，12 h表達量差異達到最大值。這與斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）被刺激隱核蟲感染后， CD8 β、IL-1 β、C型凝集素和transferrin mRNA在皮膚和鰓表達水平上升的結果一致[29]。皮膚和鰓是魚體粘膜組織，它們也是與水體病原直接接觸的部位，與水體寄生蟲最先接觸，受感染后的炎癥部位也最為明顯。皮膚表皮上有粘液細胞和囊狀細胞的分布，鰓組織的細胞中分布有大量淋巴細胞、中性粒細胞和上皮細胞等[30]。粘膜組織具有參與機體免疫應答的細胞基礎，能夠抵御寄生蟲感染和引起相關免疫應答反應。目前，許多學者認為粘膜免疫系統(tǒng)可以不依賴系統(tǒng)免疫而獨立完成抗原識別、結合和呈遞，因此局部的免疫應答對抵御病原的入侵起著重要的作用[5]。

粘膜組織（皮膚和鰓）不僅僅

是物理屏障，其局部的免疫應答對病原體的抵御也相當重

要。MHC IIB是生物體抵抗病原體侵染的免疫基因，在魚類的粘膜免疫抗原呈遞中發(fā)揮著重要作用。

注：a.擴增曲線；b.熔解曲線。

圖2 MHC IIB基因的擴增曲線和熔解曲線

注：a.鰓；b.皮膚；c.脾；d.頭腎。*表示顯著上升；§表示顯著下降。

圖3刺激隱核蟲感染大黃魚后MHC IIB基因在鰓、皮膚、脾臟和腎臟的表達分析

刺激隱核蟲感染大黃魚鰓和皮膚后，引起局部免疫應答，抗原向脾臟和頭腎轉移[28]。脾臟接收抗原刺激后，MHC IIB的表達量也顯著上升，產生免疫應答以抵御病原入侵。脾臟是魚類紅細胞與中性粒細胞產生、貯存和成熟的主要場所，頭腎可以產生紅細胞和B淋巴細胞等，相當于哺乳動物的骨髓。頭腎受感染后MHC IIB的表達量顯著下降，直至感染2 d后表達量才顯著回升。Xu TJ等研究發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）注射鰻弧菌后。MHC IIB基因在脾組織中的表達量變化不大，在肝組織中24 h后的表達量呈下降趨勢，但在96 h后表達量達到最高[11-12]，此趨勢與頭腎中MHC IIB的表達趨勢相一致。頭腎位于頭胸腔下側，緊貼脊椎，應答抗原刺激較緩慢，到受病原感染后期才產生強烈免疫應答反應。這表明MHC IIB基因的表達與組織所含有的淋巴細胞有較密切的關系，從而表現(xiàn)免疫器官有較強的基因表達，而在鰓、皮膚等部位的表達主要是因為這些器官是魚類最易接觸病原體的部位。據(jù)此推斷， MHC IIB基因在魚類刺激隱核蟲免疫應答中發(fā)揮著重要作用。

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