劉敏 李國鵬 張文征

摘要食源性致病菌是食源性疾病發(fā)生的主要病因，成為目前較為突出的公共衛(wèi)生問題之一，因此食品污染的快速檢測具有重要意義。生物傳感器為人們提供更加快速、可靠和靈敏的檢測平臺。該研究綜述了近年來幾種生物傳感器探針在食源性病原微生物檢測中的廣泛應(yīng)用，客觀地評價了各種探針的優(yōu)缺點。

關(guān)鍵詞生物傳感器；探針；噬菌體；食源性致病菌

中圖分類號S509.9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）07-001-03

Research Progess on Biosensor Probes for Detection of Food-Borne Pathogen

LIU Min， LI Guo-peng， ZHANG Wen-zheng

（Laiwu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Laiwu， Shandong 271199）

AbstractFoodborne pathogens are a major reason for food-borne disease， which have caused severe impact on society health. Therefore， rapid early detection of food contamination is relevant for the containment of pathogens. Biosensors have provided rapid， reliable and sensitive detection platforms. This review summarizes the extensive application of several biosensor probes for detection of foodborne pathogens， and critically outlines their advantages and disadvantages.

Key words Biosensors； Probe； Bacteriophage； Food-borne pathogens

食源性致病菌是食源性疾病發(fā)生的主要病因，成為目前較突出的公共衛(wèi)生問題之一，因此食品污染的快速檢測具有重要意義。傳統(tǒng)的病原菌檢測方法例如選擇性增菌和生化鑒定費時費力，免疫學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)需要復(fù)雜的樣品制備，并且不容易實現(xiàn)迷你化以便于即時檢測。近年來，生物傳感器的研究有望克服這些限制。這項技術(shù)為人們提供了更加快速、可靠和靈敏的檢測平臺。目前，生物傳感器的研究熱點在于開發(fā)新的生物學(xué)識別元件，提高目標菌的選擇性，并促進結(jié)合。噬菌體作為一種特異的生物，表現(xiàn)出杰出的宿主識別功能，被用作病原體檢測的識別探針。筆者綜述了近來噬菌體作為一種靈敏特異的生物傳感器探針在食源性病原微生物檢測中的廣泛應(yīng)用，客觀地評價了噬菌體區(qū)別于其他識別探針的優(yōu)缺點。

1生物傳感器的定義

生物傳感器是將特定的生物識別轉(zhuǎn)化為可測量的信號的分析設(shè)備。它具有高度的靈敏性和特異性，可直接應(yīng)用于加工食品的病原體檢測，樣品制備簡單，不需要費時的樣品預(yù)增菌和再增菌步驟；成本效益高，準確預(yù)測食物污染的水平和種類；小型輕便化，易實現(xiàn)原地實時檢測，縮短檢測耗時。典型的傳感器具有3個相關(guān)的部分，即由能特異性識別的生物探針組裝而成的傳感器平臺，將目的物分析捕獲情況轉(zhuǎn)換成可測量信號的轉(zhuǎn)換平臺，放大和加工信號成為分析捕獲的量化的放大器。

2識別元件

生物探針是生物傳感器最重要的部分，決定了對病原菌檢測的識別特異性。理想的生物探針應(yīng)當是穩(wěn)定性高，在傳感器平臺上易固定化，特異性識別目標物，與干擾病原體的交叉反應(yīng)最小。生物傳感器用于病原體檢測的流行的生物探針包括核酸、抗體、噬菌體、噬菌體展示肽（PDP）和新興的噬菌體受體結(jié)合蛋白（RBP）。

2.1核酸

脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和肽核酸（PNAS）是已開發(fā)應(yīng)用的分子探針?；贒NA的分子探針的主要優(yōu)勢是利用PCR來擴增病原體目標DNA序列，以此來增強檢測平臺上分子雜交的信號。RNA同樣可以利用RNA聚合酶，通過反轉(zhuǎn)錄擴增聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），達到類似效果。另外，肽核酸是DNA模擬物，通過序列特異性堿基互補配對，顯示與DNA或RNA的高親和力，由于其改良的結(jié)合特性和物理穩(wěn)定性能夠避免化學(xué)和生物降解，被視為DNA或RNA探針的可靠替代品。使用PNAS作為生物探針是一種相對較新但發(fā)展迅速的病原體檢測方法，但其應(yīng)用研究受探針合成的高成本限制?；贒NA和RNA的檢測方法簡單，穩(wěn)定，靈活，快速，節(jié)約成本。此外，基因芯片技術(shù)[1]和多重PCR [2]的發(fā)展提供了復(fù)雜食品基質(zhì)中同時檢測多種病原體的機會。此外，核酸探針（特別是DNA）在多種溶劑[3]和緩沖液中高度穩(wěn)定。這有利于在更廣范圍食品樣品中的應(yīng)用。

雖然核酸探針檢測系統(tǒng)在病原體識別中非常流行，但它的缺點限制了其應(yīng)用。基于PCR的擴增方法嚴重依賴于模板核酸的純度，易污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。同樣，模板的降解核酸可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。一個基于鏈接酶反應(yīng)的衣原體檢測系統(tǒng)在2003年從美國市場召回。由于結(jié)果[4]的重復(fù)性問題，核酸探針檢測系統(tǒng)也無法辨別細菌的存活狀態(tài)，因而不能真正反映樣品中的細菌污染情況。此外，這些系統(tǒng)不能被用于檢測某些細菌產(chǎn)生的毒素。

2.2抗體

由于抗體易固定在傳感器表面，識別目標物質(zhì)特異性水平高，抗體作為生物探針用于病原體檢測已被廣泛地探討。多克隆和單克隆抗體、抗體片段、重組抗體已被成功地用于檢測病原體、孢子和毒素以及病原體的免疫磁性分離[5]。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是抗體檢測最常用的方法，已成功地與其他生物傳感器平臺相結(jié)合?；赑CR的目標擴增和基于ELISA的檢測特異性也被合并為PCR-ELISA以獲得更佳的檢測限。佩雷勒等[6]將PCR-ELISA法成功地用于牛奶、肉類樣品中5種沙門氏菌的檢測。Abs也同樣被集成到基于光學(xué)、電化學(xué)、質(zhì)譜、磁、聲波[7-11]的檢測平臺，用于臨床標本中病原菌的檢測。

然而，抗體作為生物探針，高度依賴于物理（溫度、pH）、化學(xué)和酶條件。它們必須低溫冷藏，有效期短。這限制了它們在實驗室外條件下的應(yīng)用。多克隆抗體有多個識別表位，易發(fā)生交叉反應(yīng)，而單克隆抗體具有單一的抗原表位，但生產(chǎn)成本較高?？贵w的生產(chǎn)需要免疫動物。這涉及動物實驗的倫理問題。拜恩等[12]最近討論了抗體型傳感器檢測病原體和毒素的原理以及存在的問題和潛在的應(yīng)用。

2.3噬菌體

噬菌體是專性寄生生物，缺乏自己的代謝機制。噬菌體結(jié)合到宿主菌，將它們的DNA注入宿主中，利用宿主來增殖新的病毒，新的病毒顆粒能夠裂解細菌，感染新的宿主（裂解性噬菌體），或?qū)⑵浠蚪M整合到宿主DNA中，保持休眠狀態(tài)，直到激活復(fù)制和傳播。大多數(shù)噬菌體嚴格依賴細菌的變異水平識別宿主。除了少數(shù)例外，如李斯特菌噬菌體A511可識別、結(jié)合并殺死在整個菌屬[13]，而有些噬菌體可表現(xiàn)物種間的結(jié)合能力。據(jù)估計，1031的噬菌體存在于環(huán)境中。這提供了一個獨特的識別元素，可以將其應(yīng)用于生物傳感器進行細菌鑒定。

2.3.1

野生型噬菌體。

噬菌體結(jié)合目標病原體的固有能力已被利用來設(shè)計生物傳感器表面的物理和化學(xué)修飾。通過物理功能很容易實現(xiàn)表面吸附，但所提供的固定化密度不一致且不穩(wěn)定?；瘜W(xué)修飾由于多種優(yōu)勢而被較廣泛利用。裂解性噬菌體物理吸附已被用于檢測脫脂牛奶中金黃色葡萄球菌（檢測限104 CFU/ml）[14]和沙門氏菌[15]。同樣，對糖和氨基酸的物理吸附的噬菌體酸改性的金表面[16]以及表面改性的二氧化硅粒子[17]病原體捕獲也有文獻報道。將噬菌體與單克隆抗體的結(jié)合強度相比，發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌檢測中，噬菌體比單克隆抗體具有相似或更好的親和力[18]。

2.3.2

工程噬菌體。

基因工程為在生物傳感器中建立新的識別探針提供更大可能。下面的部分將討論轉(zhuǎn)基因噬菌體作為生物探針在病原體檢測中的應(yīng)用前景。

2.3.2.1

噬菌體展示肽。

噬菌體有在其表面上展示多肽或蛋白質(zhì)的獨特能力。這項技術(shù)是在1985年[19]首次發(fā)現(xiàn)。展示的蛋白質(zhì)或多肽能夠親和各種目標物如碳水化合物、蛋白質(zhì)、小分子或完整的細胞?；驹硎菍⒕幋a目的多肽或蛋白質(zhì)的基因融合到噬菌體表面蛋白編碼基因中，使得混合蛋白在噬菌體表面表達[20]。λ，M13，F(xiàn)1，fd，T4和T7噬菌體被廣泛用于噬菌體展示技術(shù)。利用噬菌體庫篩選出感興趣的目標物，未結(jié)合的噬菌體被沖走，緊密結(jié)合的噬菌體洗脫、擴增作為目標物的探針使用。針對不同目標物的多肽、蛋白質(zhì)、抗體或抗體片段等已成功地表達于噬菌體表面，并且在病原體檢測生物傳感器中應(yīng)用[21]。史密斯等[22]總結(jié)了噬菌體展示技術(shù)的基本模式和技術(shù)細節(jié)。

噬菌體展示技術(shù)不僅使肽和蛋白質(zhì)特異性識別，并捕獲病原體，也被利用來將生物探針固定到生物傳感器平臺。熱爾韋等[23]展示了一個頭部固定的T4噬菌體，T4噬菌體在頭部區(qū)域表達生物素，固定在鏈霉親和素包被的金基板，暴露尾部來特異性捕獲大腸桿菌。噬菌體的定向固定化也可以通過在它們頭部和尾部的物理性質(zhì)的差異加以研究。研究表明，突變體的噬菌體頭部帶有負電荷，而尾區(qū)帶有正電荷[24]。這個電荷差被用來通過靜電作用與感染李斯特氏菌、大腸桿菌的噬菌體上的正電荷纖維素膜結(jié)合[25]。噬菌體特性的這種細微差別對于傳感器平臺的廣泛應(yīng)用具有非常重要的意義。

2.3.2.2

報告噬菌體。

報告噬菌體是轉(zhuǎn)基因噬菌體。利用報告基因載體，通過感染，引入目的基因到宿主菌中。報告基因引入到宿主染色體，編碼表達一種熒光物質(zhì)或依賴比色標記的底物，從而進行病原鑒定。噬菌體任何生理功能都依賴宿主，本身無法表達報告基因，直到感染宿主，從而通過報告基因表達來確定宿主菌的存在。原核和真核細胞熒光素酶表達基因（Lux和Luc）、大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）、細菌冰核基因（inaw）和綠色熒光蛋白基因（gfp）已經(jīng)有所應(yīng)用。

報告噬菌體技術(shù)已被成功地用于識別多種病原體，包括大腸埃希菌[26]、分枝桿菌[27-29]、沙門氏菌[30]、金黃色葡萄球菌[31]、單核細胞增生李斯特氏菌[32]。盧瑟納等[33]成功地使用報告噬菌體檢測乳清干酪、巧克力布丁和白菜中的李斯特氏菌，對更多的微生物復(fù)合食品樣品如肉末、軟奶酪用相同的方法檢測，檢測限達10個菌/g。與4 d的常規(guī)的微生物學(xué)方法相比，總的檢測時間約為24 h。報告噬菌體最大的優(yōu)勢是能夠區(qū)分活的和死的細菌，因為噬菌體將不能在死的細菌中感染和表達報告基因。然而，報告噬菌體也會受到限制，如由于DNA限制修飾系統(tǒng)[34]、噬菌體抑制基因[35]、抗病毒細菌免疫系統(tǒng)[36]的存在，噬菌體增殖受到抑制。

2.3.2.3

噬菌體受體結(jié)合蛋白（RBP）。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體的RBP可作為一種新型的病原檢測探針。一些噬菌體RBP具有獨特的宿主尾部識別特異性，能識別宿主尾部纖維。這些蛋白質(zhì)的結(jié)合可觸發(fā)噬菌體將遺傳物質(zhì)插入宿主[37]。噬菌體的RBP還具有對宿主菌表面蛋白質(zhì)或糖[38]序列的獨特的識別能力。近來基于基因組信息學(xué)的進步，利用分子生物學(xué)方法克隆RBP的特異識別基因，將感興趣的基因組克隆、轉(zhuǎn)染、表達出感興趣的蛋白質(zhì)。這些進步已大大促進了噬菌體技術(shù)的發(fā)展[39-40]。RBP還提供了對環(huán)境條件良好的穩(wěn)定性，如pH、溫度和電阻穩(wěn)定性[39]。最重要的是，合適的標簽可以被添加到適當?shù)男蛄形恢?，并不改變它們的結(jié)合親和力，這樣的標簽可被用于生物傳感器平臺表面官能化基團的構(gòu)建。辛格等[41]研究了半胱氨酸標記的噬菌體RBP在鼠傷寒沙門氏菌的檢測中的應(yīng)用，結(jié)果表明半胱氨酸標記的RBP能夠有效地捕捉細菌。

3 展望

噬菌體探針應(yīng)用潛力巨大，但由于宿主特異性太強（高達血清水平），潛在目標范圍窄。這限制了它在病原體生物傳感器中的開發(fā)應(yīng)用。從生物的角度來看，宿主/目標的選擇性是非常可取的。這意味著同一檢測平臺需要幾種不同的識別探針，以識別所有細菌的致病性血清型。授予噬菌體多價性成為設(shè)計能同時檢測多種病原體的生物傳感器的關(guān)鍵因素，有待開發(fā)。另外，筆者從事食品中微生物檢測工作多年，發(fā)現(xiàn)一些復(fù)雜基質(zhì)的食品樣品中常由于特殊物質(zhì)而影響致病菌檢測，存在巨大的食品安全隱患，因此利用噬菌體生物傳感器來檢測此類食品中致病菌具有較大的應(yīng)用價值。

43卷7期

劉 敏等生物傳感器探針在致病菌檢測中的研究進展

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