李海霞　曹焱　白卉等

摘要[目的]分析分月扇舟蛾顆粒體病毒蛋白基因的序列。[方法]針對分月扇舟蛾顆粒體病毒granulin基因進行PCR擴增，分析其核苷酸組成和氨基酸序列。[結(jié)果]測序得到498 bp的核苷酸序列片斷，GC含量47.9%，AT含量52.1%。該基因蛋白序列等電點為5.42，分子量1.981 9×104 Da。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（38.55%）、β折疊（18.07%）、β轉(zhuǎn)角（10.24%）和無規(guī)卷曲（33.13%）組成，其中，α螺旋為主要結(jié)構(gòu)。[結(jié)論]分月扇舟蛾顆粒體蛋白基因與楊扇舟蛾的相似性最高，親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞分月扇舟蛾； 顆粒體蛋白基因；序列測定

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）07-032-03

分月扇舟蛾（Clostera anastomosis L.）是楊樹的暴發(fā)性食葉害蟲之一，在東北地區(qū)主要發(fā)生在楊樹的人工林和次生林中，經(jīng)常造成嚴重的危害[1]。分月扇舟蛾顆粒體病毒作為顆粒體病毒的一種，在農(nóng)業(yè)病蟲害防治中發(fā)揮了很大的作用，但其基因水平的研究較缺乏[2]，筆者首次報道了分月扇舟蛾顆粒體病毒的顆粒體蛋白基因，它的測定為以后其他基因的篩選以及分月扇舟蛾顆粒體病毒基因組文庫的構(gòu)建提供一定的參考價值。

1材料與方法

1.1試驗材料

病毒的分離：從楊樹林間采集病死幼蟲，保存在4 ℃冰箱中。蟲尸經(jīng)過研缽研磨、三層紗布過濾，采用差速離心法純化病毒。濾液先以800 r/s 低速離心20 min，離心3次，去掉沉淀，再以12 000 r/s高速對上清液離心30 min，離心3次，最后得到的白色沉淀即為純化的GV[3]。

1.2試驗方法

1.2.1蛋白基因的純化和DNA的提取。

取純化的病毒懸液，加400 μl堿解液（0.1 mol/L Na2CO3，0.15 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA，pH 10.5），堿解2 h，加入SDS靜置30 min，溶液變清，12 000 r/min離心5 min，取上清液，用500 μl酚、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）各抽提1次，上清液用2倍體積無水乙醇沉淀，75%乙醇洗滌，最后得到的DNA沉淀溶于30 μl水中，保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2蛋白基因的引物設(shè)計。

參照楊扇舟蛾顆粒體病毒（CacGV）、蘋果蠹蛾顆粒體病毒（CpGV）、苜蓿綠葉蛾顆粒體病毒（PsGV）、云杉芽卷葉蛾顆粒體病毒（CmGV）、茶小卷葉蛾顆粒體病毒（AoGV）、美國白蛾顆粒體病毒（HcA5-1GV）蛋白基因設(shè)計兼并引物。

引物序列為上游：5′-CBGGHAARAAYGWDMGVATCAC-3′，

下游：5′-AACARDAGVGAYACYTCRATC-3′。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3DNA序列測定及序列分析。

序列測定由上海生工生物工程有限公司完成，核苷酸序列以及氨基酸序列的相似性分析軟件為ClustalX（W），分析所用的各種顆粒體病毒數(shù)據(jù)均來自GenBank數(shù)據(jù)庫。密碼子偏向性分析運用歐洲分子生物學(xué)開放軟件包（EMBOSS），運行chips和cusp程序?qū)ζ溥M行計算及分析[4]；疏水性分析利用Bioedit軟件采用Kyte和Doolittle算法[5]，聯(lián)網(wǎng)至http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/對該蛋白序列進行跨膜區(qū)分析，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SOPMA法[6-7]。

2結(jié)果與分析

2.1CaGV granulin基因的序列分析

CaGV granulin基因的核苷酸序列見圖1。對測序所獲得的序列進行核酸組成分析，測序得到498 bp的片斷，GC含量47.9%，AT含量52.1%。

2.2CaGV granulin的相似性分析

應(yīng)用Clustalxl.81軟件比較新測定的CaGV granulin與較為典型的6種GV的granulin基因的相似區(qū)，結(jié)果見圖2。這7種顆粒體蛋白基因核苷酸與氨基酸的相似性分析見表1。

核苷酸序列的相似性分析表明，CaGV granulin基因的核苷酸序列與CacGV（楊扇舟蛾顆粒體病毒）、PsGVA25-6（苜蓿綠夜蛾顆粒體病毒）、HcGVA5-1（美國白蛾顆粒體病毒）、CpGVA11-2（蘋果蠹蛾顆粒體病毒）、CmGVA11-1（云杉芽卷

圖1CaGV granulin基因核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

注： “*”表示7種顆粒體病毒完全保守的氨基酸殘基；“：”表示性質(zhì)相似的氨基酸殘基；“.”表示弱作用殘基；“-”表示插入或缺失的氨基酸殘基。

圖27種顆粒體病毒蛋白基因氨基酸序列的比較

表1顆粒體蛋白基因的核苷酸序列（上）及氨基酸序列（下）的相似性分析

%

項目CaCacPsA25-6HcA5-1CpA11-2CmA11-1AoS45

Ca-97.5981.8673.2981.3480.5781.33

Cac98.18-82.5273.3280.4281.3382.20

PsA25-692.7394.71-74.1383.2080.5681.53

HcA5-182.0082.3584.97-76.7274.1972.23

CpA11-295.0694.1294.5883.01-81.6081.93

CmA11-195.6896.3994.5883.0195.78-79.72

AoS4594.5596.4794.1281.7096.9995.18-

葉蛾顆粒體病毒）、AoGVS45（茶小卷葉蛾顆粒體病毒）granulin基因核苷酸序列的相似性分別為97.59%、81.86%、73.29%、81.34%、80.57%、81.33%，顯示了很高的同源性；由核苷酸推導(dǎo)的氨基酸序列之間的比較結(jié)果也相似，CaGV granulin基因的氨基酸序列與CacGV、PsGVA25-6、HcGVA5-1、CpGVA11-2、CmGVA11-1、AoGVS45 的相似性分別為98.18%、92.73%、82%、95.06%、95.68%、94.55%。

2.3Granulin基因蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)分析

2.3.1氨基酸的成分分析。

根據(jù)測定的核苷酸序列推測該基因編碼166氨基酸，共有20種，由22個酸性氨基酸、18個堿性氨基酸、89個中性氨基酸組成，其中谷氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸含量最高，含量較少的是丙氨酸、半胱氨酸、組氨酸、色氨酸（表2）。通過Compute pI/Mw對CaGV granulin基因編碼的蛋白序列進行分析，等電點為5.42，分子量1.981 9×104 Da，顆粒體蛋白基本是電中性，這對于形成顆粒體保持電中性是有意義的。親水性氨基酸70個占42.17%，疏水性氨基酸79個占47.58%，兩者占整個氨基酸的89.75%，說明顆粒體蛋白基因中富含親水性氨基酸和疏水性氨基酸。

表2CaGV蛋白基因的氨基酸組成

氨基酸數(shù)目Mol∥%氨基酸數(shù)目Mol∥%

Asp84.82Asn84.82

Glu148.43Ile137.83

Lys74.22Thr106.02

Arg116.63Leu137.83

Ser95.42Ala42.41

Phe127.23Met53.01

Val106.02Cys31.81

Gly63.61Pro106.02

Gln84.82Trp42.41

His31.81Tyr84.82

2.3.2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

利用SOPMA程序?qū)Ψg的氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)分析，具體分布見圖3。

注：h代表α螺旋，e代表β折疊，t表示β轉(zhuǎn)角，c代表無規(guī)卷曲。

圖3CaGV蛋白基因的二級結(jié)構(gòu)

由圖3可知，CaGV蛋白基因二級結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，分別由α螺旋（38.55%）、β折疊（18.07%）、β轉(zhuǎn)角（10.24%）和無規(guī)卷曲（33.13%）組成，其中α螺旋為主要結(jié)構(gòu)。

3結(jié)論

該研究通過PCR擴增得到了分月扇舟蛾顆粒體病毒granulin基因的部分序列，針對該序列分析其核苷酸組成，根據(jù)核酸序列推測了其氨基酸序列，在此基礎(chǔ)上利用clustalxl.81軟件對典型的7種顆粒體病毒的granulin基因進行了相似性分析。結(jié)果表明，分月扇舟蛾顆粒體蛋白基因與楊扇舟蛾的相似性最高，親緣關(guān)系最近；并對該基因蛋白質(zhì)基本性質(zhì)進行研究，分析了該基因編碼區(qū)的蛋白組成，其等電點為5.42，分子量1.981 9×104 Da；預(yù)測了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該基因的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（38.55%）、β折疊（18.07%）、β轉(zhuǎn)角（10.24%）和無規(guī)卷曲（33.13%）組成，其中α螺旋為主要結(jié)構(gòu)。

參考文獻

[1] 車永貴，張家利，朱華年.分月扇舟蛾生物學(xué)特性及其綜合防治[J].吉林林業(yè)科技，2001，30（5）：18-26.

[2] 張麗紅，彭建新，洪華珠.顆粒體病毒的離體復(fù)制[J].微生物學(xué)雜志，2004，24（1）：60-62.

[3] 李海霞.分月扇舟蛾顆粒體病毒病理、毒力及蛋白基因的研究[D].北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2006.

[4] 王艷，馬文麗，鄭文嶺.SARS冠狀病毒的密碼子偏愛性分析[J].生命科學(xué)研究，2003，7（3）：219-224.

[5] 張成崗，賀福初.生物信息學(xué)方法與實踐[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[6] 黃韌，薛成.生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源與應(yīng)用[M].廣州：中山大學(xué)出版社，2003.

[7] 張陽德.生物信息學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2004.