王曉麗　王曉玲　常楚瑞

摘要[目的]揭示不同產(chǎn)地金櫻子30個(gè)居群間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。[方法]采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，從35條RAPD隨機(jī)引物中，篩選出8條有效引物進(jìn)行擴(kuò)增，用NTSYSpc，ver.2.02軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析。[結(jié)果]共擴(kuò)增出86條帶，其中多態(tài)性條帶84條，多態(tài)性百分率（PPB）97.67%。30個(gè)居群的相似性系數(shù)在0.11～0.58，聚成A、B、C三大類群。[結(jié)論]金櫻子具有豐富的遺傳多態(tài)性，產(chǎn)自貴州地區(qū)的金櫻子有較近的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞金櫻子；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)S188；R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）07-023-02

金櫻子為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx.的干燥成熟果實(shí)，又名倒蜂糖罐、糖桔子、刺梨子、山石榴等，性酸、澀、平，能補(bǔ)腎益氣、補(bǔ)血益精、澀精縮尿、止瀉。久服令人耐寒輕身?，F(xiàn)代藥理研究表明，金櫻子具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降低血清膽固醇含量、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等功能，并有明顯的抑菌及抗病毒等作用。主要用于治療尿頻遺尿、遺精滑精、久瀉久痢、白帶過多、婦女子宮脫垂等癥。因其富含維生素C、糖等，民間將其果實(shí)作為食用；也可用于泡酒，金櫻子酒具有滋補(bǔ)、強(qiáng)身健體的功效。2002年，我國衛(wèi)生部將金櫻子列入保健食品的行列。金櫻子具有藥食同源的重要價(jià)值，開發(fā)應(yīng)用前景十分廣闊，經(jīng)濟(jì)效益潛力頗大。金櫻子在我國西南、華南、華中、華東均有分布，尤其以貴州分布最廣，產(chǎn)量最高，是貴州大宗藥材之一。目前關(guān)于全櫻子隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析國內(nèi)外尚未見報(bào)道[1-5]。為了探討以貴州為主不同生長地區(qū)金櫻子的遺傳分化情況，筆者在DNA分子水平上，采用RAPD（DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性）分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)金櫻子的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，為對(duì)金櫻子優(yōu)良性評(píng)價(jià)和資源保護(hù)具有十分重要的意義。

1材料與方法

1.1供試樣品

于2012年，主要采集于貴州及相鄰省份，不同產(chǎn)地品種共30個(gè)居群，經(jīng)貴陽醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為金櫻子Rosa laevigata Michx.（表1）。

表1樣品編號(hào)及產(chǎn)地

1.2試劑

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨，F(xiàn)arco），PVP（聚乙烯吡咯烷酮，Basf），瓊脂糖（Promega），溴化乙錠（EB， Sigma），RNASE（Promega），限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶、聚丙烯酰胺等均購自上海生物工程有限公司。

1.3儀器

低溫高速離心機(jī)（BECKMAN，GS-15R）；凝膠成像儀（UVP，GDS7600G）；電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.4金櫻子基因組DNA的提取

DNA提取采用CTAB法[6-7]。

1.5引物篩選[8]

先用1個(gè)DNA 樣品，對(duì)引物初選，再用4個(gè)樣品DNA 進(jìn)行第2 次篩選，選取多態(tài)性高的8個(gè)引物用于RAPD 試驗(yàn)，這8個(gè)引物分別為S1：GTTTCGCTCC，S22：TGCCGAGCTG，S5：TGCGCCCTTC，S29：GGGTAACGCC，S6：TGCTCTGCCC，S40：GTTGCGATCC，S10：CTGCTGGGAC，S45：TGAGCGGACA。

1.6PCR反應(yīng)體系和程序

PCR反應(yīng)體系總體積20 μl：ddH2O 6.5 μl，2×PCRMix10 μl，引物（10 μmol/L ）1.5 μl，DNA 2 μl。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性8 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s、36 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min） ，最后在72 ℃下延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物加2 μl上樣緩沖液（40%蔗糖、0.25%溴酚藍(lán)） ，經(jīng)電壓110 V，電泳50 min，1.5%瓊脂糖檢測，然后用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色10 min，并在凝膠成像儀（UVP，GDS7600G）系統(tǒng)下拍照記錄。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)2 次，確定所得條帶的可重復(fù)性。

1.7數(shù)據(jù)分析

記錄金櫻子RAPD擴(kuò)增出的總條帶數(shù)，記錄可辨認(rèn)的、2次擴(kuò)增結(jié)果一致的條帶。經(jīng)Gel-Pro Analyzer Version 4.5軟件識(shí)別，根據(jù)擴(kuò)增條帶的遷移率，同一遷移率有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，采用軟件SYSpc， ver.2.2計(jì)算金櫻子各樣品的遺傳相似度，繪制聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1金櫻子DNA檢測結(jié)果

金櫻子DNA檢測結(jié)果見圖1。由圖1可知，電泳條帶較為清晰可辨，說明供試DNA樣品的濃度適合于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2RAPD引物擴(kuò)增檢測結(jié)果

參考薔薇科部分植物多態(tài)性隨機(jī)引物，從35個(gè)隨機(jī)引物中篩選出8個(gè)重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)的引物擴(kuò)增，共得到86條帶，其中84條表現(xiàn)出多態(tài)性，占總帶數(shù)的97.67%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增的DNA帶數(shù)為

10.75條。擴(kuò)增位點(diǎn)分子量在200～2 000 bp（圖2）。

圖1金櫻子DNA檢測結(jié)果

圖2引物S45的RAPD指紋圖譜

2.3 聚類分析

由圖3可知，金櫻子RAPD擴(kuò)增結(jié)果的遺傳相似性系數(shù)在0.11～0.58，生長在不同地區(qū)金櫻子的DNA具有一定的變異，供試品金櫻子聚成了A、B、C三大類群。產(chǎn)自貴州銅仁的1～2號(hào)供試品聚為A類，產(chǎn)自烏當(dāng)、馬鈴、黔桃、金沙、丹寨、興仁、都勻、三都的3～29號(hào)供試品聚為B類；產(chǎn)自廣東肇慶的30號(hào)供試品單獨(dú)聚為C類。A、B兩類群的親緣關(guān)系較近，C與A、B的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3金櫻子RAPD分子標(biāo)記UPGMA聚類圖

3結(jié)論與討論

（1）該試驗(yàn)通過嚴(yán)格控制反應(yīng)體系和條件，得到重復(fù)性好的擴(kuò)增結(jié)果，有效地揭示供試樣品金櫻子種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性與寬廣的遺傳基礎(chǔ)。廣義的遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和。狹義的遺傳多樣性是指種內(nèi)的遺傳多樣性，即種內(nèi)個(gè)體之間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和。物種的遺傳多樣性越高，遺傳變異越豐富，對(duì)外界環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，說明物種生存繁衍的能力越強(qiáng)。因而，可以利用其優(yōu)良變異類型，創(chuàng)造新的變異，選育優(yōu)良品種 [9-10]。

（2）該試驗(yàn)從35個(gè)RAPD引物中篩選出8個(gè)可擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定圖譜的引物，用于指紋圖譜構(gòu)建，共擴(kuò)增出86條帶，其中多態(tài)性條帶84條，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）達(dá)97.67%。

（3）通過聚類分析，結(jié)果表明，30個(gè)居群RAPD擴(kuò)增結(jié)果的遺傳相似性系數(shù)在0.11～0.58，聚成A、B、C三大類群。

A、B兩類群的親緣關(guān)系較近，C與A、B的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

地理分布越近，金櫻子居群間的遺傳差異越小。產(chǎn)自貴州地區(qū)的金櫻子之間有較近的親緣關(guān)系。

（4）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥用

植物種質(zhì)資源及品種鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系的研究。遺傳資源保存和品種資源目錄的建立都依賴對(duì)其遺傳多樣性及親緣關(guān)系的掌握，該研究采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）技術(shù)，為金櫻子種質(zhì)提供準(zhǔn)確的遺傳信息，并對(duì)其遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行了科學(xué)分析，該研究結(jié)果對(duì)金櫻子品種指紋圖譜的構(gòu)建、品質(zhì)評(píng)價(jià)、種質(zhì)資源保護(hù)等具有重要意義[11-14]。

參考文獻(xiàn)

[1]

貴州省中藥資源普查辦公室，貴州省中藥研究所. 貴州中藥資源[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 1992：293-296.

[2] 李連芳，王曉麗. 貴州產(chǎn)金櫻子多糖的含量測定[J]. 貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，38（2）：162-168.

[3] 曹運(yùn)長，文紅波，吳玉蘭，等. 金櫻子總黃酮對(duì)過氧化氫損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2013， 24（5）：1159-1161.

[4] 劉學(xué)貴，李佳駱，高品一，等.藥食兩用金櫻子的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2013，34（11）：392-398.

[5] 陳祖云，王曉麗，宋聚先.貴州天麻遺傳多態(tài)性的ISSR初步分析[J].中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（7）：436-439.

[6] 王曉玲，王曉多.天麻總DNA提取的研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代，2005，7（2）：110-111.

[7] 鄒佳寧，宋聚先，常楚瑞，等.貴州天麻種質(zhì)資源的RAPD分析[J].中藥材，2006，29（9）：881-883.

[8] 陳陽，周先治，陳晟，等.花椰菜RAPD隨機(jī)引物的篩選[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（12）：22-25.

[9] 陳祥平，范小敏，柯皓天，等.湖北省桑屬植物親緣關(guān)系RAPD分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（7）：1917-1920.

[10] MA X，CHEN S Y，BAI S Q，et al. RAPD analysis of genetic diversity and population structure of Elymus sibiricus（ Poaceae ） native to the southeastern Qinghai Tibet Plateau，China[J]. Genet Mol Res，2012，11（ 3） ： 2708-2718.

[11] 李小梅，張立微，張景濤.芫荽遺傳多樣性RAPD分析[J].北方園藝，2014（15）：97-100.

[12] 王曉麗，王曉玲，王曉多.天麻親本材料的分子標(biāo)記[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（2）：10-12.

[13] 王曉麗，陳祖云，宋聚先.野生與雜交天麻的DNA標(biāo)記鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（27）：14860，14916.

[14] 王曉麗，常楚瑞，宋聚先，等.天麻不同種質(zhì)的AFLP和SSR分析[J].中華中醫(yī)藥雜志（原中國醫(yī)藥學(xué)報(bào)），2012，27（3）：555-558.