金磊

摘要[目的]研究預(yù)混系統(tǒng)對(duì)于PCR以及其下游試驗(yàn)是否會(huì)產(chǎn)生影響。 [方法]采用“dye”及“density”預(yù)混的PCR系統(tǒng)與正常PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR以及下游試驗(yàn)，使用瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop2000檢測(cè)。[結(jié)果]預(yù)混系統(tǒng)與正常系統(tǒng)對(duì)于PCR產(chǎn)物的特異性以及質(zhì)量未見明顯差別。[結(jié)論]預(yù)混系統(tǒng)也完全適合于下游的轉(zhuǎn)化、連接、酶切試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞PCR；預(yù)混系統(tǒng)；正常系統(tǒng)

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2015）07-021-02

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction， PCR）是體外擴(kuò)增特異性DNA片段的技術(shù)，是DNA重組技術(shù)的一次飛躍。近30年間出現(xiàn)許多衍生的PCR技術(shù)，如多重PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，這些技術(shù)大大促進(jìn)了分子克隆的發(fā)展，尤其是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展結(jié)合蛋白質(zhì)定量分析，為研究基因表達(dá)及相關(guān)蛋白質(zhì)功能分析提供了有力手段[1-2]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)將染色劑SYBR Green I 預(yù)混在PCR系統(tǒng)中進(jìn)行PCR反應(yīng)，SYBR Green I與雙鏈DNA結(jié)合而激發(fā)熒光的特性來定量檢測(cè)[3]。在PCR系統(tǒng)中預(yù)混指示劑、聚蔗糖等使得PCR反應(yīng)完畢后可直接上樣檢測(cè)，使用方便，但對(duì)于PCR下游的分子克隆如連接、酶切是否會(huì)產(chǎn)生影響尚不明確。筆者使用預(yù)混“dye”及“density”的PCR系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱預(yù)混系統(tǒng)）進(jìn)行PCR以及下游的連接、酶切試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，正常PCR系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱正常系統(tǒng)）作為參照，研究預(yù)混系統(tǒng)對(duì)于PCR以及其下游試驗(yàn)是否會(huì)產(chǎn)生影響。

1材料與方法

1.1主要試劑

DNA ladder、限制性內(nèi)切酶（Hind Ш、Nco I）、T4 DNA連接酶購(gòu)買于NEB公司，PCR Master Max、p-EGMT載體瓊脂糖購(gòu)買于promega公司，Green PCR Master Max購(gòu)買于Thermo scientific公司，LB培養(yǎng)基、LB瓊脂均購(gòu)自Invitrogen公司，PCR純化試劑盒、柱式質(zhì)粒DNA提取試劑盒、特異性引物購(gòu)買于生工（上海）生物工程有限公司。

載體與菌株：pGEM-T載體、大腸桿菌JM101為徐州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1PCR反應(yīng)。50 μl PCR體系：質(zhì)粒1 μl，2xPCR Master Mix 25 μl，上下游引物各5 μl，無核酶水14 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.2PCR產(chǎn)物純化。使用生工（上海）生物工程有限公司的柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)操作步驟參見操作手冊(cè)。

1.2.3連接。取1 μl PCR純化產(chǎn)物加入含有p-EGMT載體以及T4 DNA連接酶的體系，16 ℃ 水浴連接4 h。

1.2.4轉(zhuǎn)化。取5 μl連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物加入100 Ul感受態(tài)細(xì)胞JM101中，冰浴30 min，立即轉(zhuǎn)入42 ℃水浴1 min，然后再轉(zhuǎn)移至冰浴2 min，加入300 μl LB，37 ℃培養(yǎng)1 h后取50 μl涂布于準(zhǔn)備好的含有氨芐青霉素的平板，倒置于37 ℃ 培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

1.2.5酶切。取10 μl質(zhì)粒，加入含有Hind Ш、Nco I的雙酶切體系，37 ℃ 培養(yǎng)箱酶切1 h。

2結(jié)果與分析

2.1PCR產(chǎn)物定量檢測(cè)

為了檢測(cè)預(yù)混系統(tǒng)對(duì)于PCR反應(yīng)是否產(chǎn)生影響，使用PCR預(yù)混系統(tǒng)及正常系統(tǒng)克隆同一個(gè)目的基因（711 bp）（圖1），僅有目的基因出現(xiàn)在700 bp左右，2種系統(tǒng)的PCR產(chǎn)物均無非特異性條帶，使用Nanodrop2000 測(cè)定其濃度，3次試驗(yàn)結(jié)果平均值分別為73與77 ng/μl，無明顯差異。因此，預(yù)混系統(tǒng)及正常系統(tǒng)在PCR的特異性及PCR的產(chǎn)量方面無明顯差異。

注：1.預(yù)混系統(tǒng)PCR；3.正常系統(tǒng)PCR；2，4.DNA laddrer。

圖1PCR結(jié)果

2.2PCR 產(chǎn)物連接效率檢測(cè)

為了驗(yàn)證預(yù)混系統(tǒng)對(duì)于PCR產(chǎn)物的連接有無影響，使用2種系統(tǒng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后涂布于具有氨芐抗性的LB瓊脂平板，過夜培養(yǎng)后隨機(jī)挑選6個(gè)菌落進(jìn)行質(zhì)粒DNA的小量制備，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其大小，結(jié)果見圖2，由圖2可知，3號(hào)質(zhì)粒的移動(dòng)較其余質(zhì)粒慢，表示形成重組質(zhì)粒的可能性較大，經(jīng)過酶切鑒定確認(rèn)為正確的重組子。此試驗(yàn)重復(fù)5次，得出預(yù)混系統(tǒng)與正常系統(tǒng)的連接效率分別為23.3%、26.7%，兩者并無明顯差別，因此，認(rèn)為預(yù)混系統(tǒng)與正常系統(tǒng)對(duì)PCR下游連接試驗(yàn)無明顯差異。

注：3.正確連接的重組子；1、2、4、5、6.未連入的閉環(huán)載體。

圖2連接效率檢測(cè)

2.3酶切鑒定重組子

使用酶切法鑒定重組子，選擇預(yù)混系統(tǒng)與正常系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的重組子，在設(shè)計(jì)引物時(shí)上下游引物中分別加入酶切位點(diǎn)Hind Ш與Nco I，因此使用Hind Ш、Nco I進(jìn)行雙酶切可以將目的基因切下。由圖3可知，預(yù)混系統(tǒng)與正常系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的重組子酶切結(jié)果有2條亮帶，分子量較大的是p-EGMT載體，分子量較小的是目的基因，因不明原因使得DNA ladder中條帶分辨不清，但仍可以判斷目的基因（711 bp）在500～1 000 bp，考慮到雙酶切且無非特異性條帶，因此可以斷定500～1 000 bp的條帶是目的基因。對(duì)于PCR下游的酶切反應(yīng)，預(yù)混系統(tǒng)與正常系統(tǒng)無明顯差異。

3討論

PCR 技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)的里程碑，由于研究目的、技術(shù)要求不同，商品化的PCR試劑盒也根據(jù)實(shí)

際需要作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，形成了適合現(xiàn)代科學(xué)研究的技術(shù)平臺(tái)。

注：1.預(yù)混系統(tǒng)連接重組子的酶切產(chǎn)物；2.正常系統(tǒng)連接重組子的酶切產(chǎn)物；3.DNA ladder。

圖3酶切鑒定重組子

該研究針對(duì)預(yù)混“dye”及“density”的PCR系統(tǒng)進(jìn)行了多項(xiàng)檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)和正常PCR系統(tǒng)的差異，且可以直接上樣檢測(cè)，在操作上簡(jiǎn)化了步驟，特別適合試驗(yàn)教學(xué)的開展。

另外，PCR系統(tǒng)經(jīng)過不斷創(chuàng)新出現(xiàn)了大量的衍生品試劑盒，對(duì)于PCR操作的成功率以及便利性具有很大提高，如DNA Taq酶經(jīng)凍融多次后仍具有很高的活性，可以將DNA Taq酶、Mg2+ 、dNTP等按照一定比例混合在緩沖液中，大大簡(jiǎn)化了PCR操作步驟，提高M(jìn)g2+ 濃度可以拮抗染色劑、指示劑等對(duì)于PCR系統(tǒng)的抑制，出現(xiàn)了SYBR等染色劑預(yù)混的實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，對(duì)于核酸與蛋白質(zhì)功能的研究提供了新的手段[4]；針對(duì)模板鏈的特點(diǎn)也出現(xiàn)了一些PCR試劑盒，如高GC含量PCR試劑盒、超長(zhǎng)鏈PCR試劑盒、熱啟動(dòng)PCR試劑盒等。隨著技術(shù)的發(fā)展及不斷創(chuàng)新，PCR 技術(shù)正向簡(jiǎn)便、快捷、個(gè)性化、高質(zhì)量、智能化的方向發(fā)展，同時(shí)PCR 技術(shù)的應(yīng)用也將不斷深入到科學(xué)研究的更多方面。

參考文獻(xiàn)

[1]

鄭景生，呂蓓.PCR 技術(shù)及實(shí)用方法[J].分子植物育種，2006，1（3）： 381-394.

[2] 李玉梅，姚紀(jì)元，吳靜.PCR-SSCP 技術(shù)的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2007（6）：71-74.

[3] 劉歆，徐根明，郭江峰，等.基于SYBR Green I的雙鏈DNA定量方法[J].中國(guó)生物工程雜志，2008，28（1）： 55-60.

[4] TUMA R S，BEAUDET M P，JIN X K，et al.Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain：A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transillu minators[J].Analytical Biochemistry，1999，268：278-288.