蔣小強(qiáng)　邱紅輝　符乃方等

摘要[目的] 研究紅茶菌和中草藥紅茶菌在體外對(duì)霍亂弧菌的抑制作用。 [方法] 采用試管稀釋法（MIC），研究紅茶菌與中草藥紅茶菌對(duì)霍亂弧菌的體外抑制作用。 [結(jié)果] 紅茶菌與中草藥紅茶菌對(duì)霍亂弧菌都具有一定的抑菌作用，尤其是中草藥紅茶菌原液對(duì)高濃度的霍亂弧菌具有顯著的抑菌作用。[結(jié)論]與紅茶菌相比，中草藥紅茶菌對(duì)霍亂弧菌具有顯著的抑菌作用，在臨床上可用于對(duì)霍亂弧菌感染的預(yù)防。

關(guān)鍵詞紅茶菌；中草藥紅茶菌；霍亂弧菌；抑制

中圖分類號(hào)S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）07-004-03

Study on Inhibition of Vibrio cholerae by Kombucha and Chinese Herbal Kombucha in vitro

JIANG Xiao-qiang1， QIU Hong-hui1， FU Nai-fang2， JIANG Sheng-jun2* et al

（1. Center for Animal Disease Control and Prevention， Dongfang Animal and Husbandry Bureau， Dongfang， Hainan 570100； 2. Tropical Crop Germplasm Resources Institute， China Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract[Objective] To study the inhibitory effects of Vibrio cholerae by kombuchab and Chinese herbal kombucha in vitro. [Method] Using the tube dilution method to study the inhibition effect of Vibrio cholerae by kombuchaand Chinese herbal kombucha in vitro. [Result] Both Kombucha and Chinese herbal kombucha have antibacterial effects for Vibrio cholerae， and Chinese herbal Kampuchea has strong antibacterial effect for Vibrio cholerae with high concentration. [Conclusion] Compared with kombucha， Chinese herbal Kombucha has antibacterial effect significantly on Vibrio cholerae， which would be used to prevent clinical infection of Vibrio cholerae.

Key wordsKombucha； Chinese herbal kombucha； Vibrio cholerae； Inhibition

紅茶菌保健飲料是一種由醋酸桿菌、酵母菌和乳酸菌等發(fā)酵紅茶糖水所形成的微生態(tài)茶飲料。國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界多年的研究和醫(yī)學(xué)實(shí)踐表明，飲用紅茶菌飲料能有效預(yù)防和治療多種慢性疾病，如預(yù)防癌癥、治療消化不良、緩解關(guān)節(jié)炎、治療高血壓等[1]。此外，紅茶菌自身不僅易于存活和繁殖，而且具有很強(qiáng)的殺菌、拮抗和抑菌作用[2]。紅茶菌的主要抑菌成分為有機(jī)酸、茶葉提取液成分以及紅茶菌產(chǎn)生的抑菌蛋白成分[3-9]。為了進(jìn)一步增強(qiáng)紅茶菌的抑菌活性，除添加茶葉外，還添加甘草、菊花、羅漢果、啤酒花等中草藥，制備出新型中草藥紅茶菌制劑[10]?；魜y弧菌是一種能特異引起人體劇烈腹瀉癥狀的病菌。霍亂弧菌的主要致病機(jī)理是它主要分泌霍亂腸毒素與小腸黏膜上皮受體結(jié)合且進(jìn)入細(xì)胞膜，作用于腺昔酸環(huán)化酶，使得ATP轉(zhuǎn)變?yōu)閏AMP，小腸上皮細(xì)胞分泌功能亢進(jìn)，導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉和嘔吐[11]。Toda等[12]研究表明，紅茶提取物對(duì)霍亂弧菌V569B 和V8 6 在1 h內(nèi)均可殺滅，特別是V569B幾乎在接觸后立刻被殺滅。紅茶提取物還可以在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中破壞霍亂毒素的作用。在體內(nèi)試驗(yàn)中，紅茶抽提物在CT 處理后5～30 min內(nèi)均能抑制毒素作用，而在30 min 以后則無(wú)此效果。Toda等[13]進(jìn)一步研究表明，兒茶素類在生物模型中也具有以上作用。在發(fā)達(dá)國(guó)家，由于衛(wèi)生水平的提高，霍亂弧菌導(dǎo)致的病例日漸減少；但是，在發(fā)展中國(guó)家，霍亂弧菌導(dǎo)致的病例居高不下。雖然利用霍亂疫苗可以有效地預(yù)防霍亂，但是由于有效期短以及經(jīng)濟(jì)原因而難以在這些發(fā)展中國(guó)家推廣。因此，探索利用低成本、高效的中草藥微生態(tài)制劑預(yù)防霍亂，是值得研究發(fā)展的方向。霍亂弧菌的最適培養(yǎng)pH為6.5～7.5，屬于喜歡偏中性以及弱堿性的病原菌。因此，能夠產(chǎn)生大量有機(jī)酸以及耐酸性強(qiáng)的益生菌都能有效地抑制或拮抗霍亂弧菌。紅茶菌包含自然界產(chǎn)酸性最強(qiáng)的醋酸菌，因此紅茶菌能有效地抑制霍亂弧菌[6-7，9] 。為了比較紅茶菌和中草藥紅茶菌的抑菌特性，筆者以霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)株試驗(yàn)菌種研究紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)霍亂弧菌的抑菌效果，為臨床上預(yù)防霍亂弧菌的感染提供理論和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種O139群霍亂弧菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株MO45（Vibrio cholerae O139 international reference strain MO45）。該菌種由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所腹瀉病室鑒定、保存和提供。紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑為本實(shí)驗(yàn)室制備[10]。過(guò)濾的紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑用一次性微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾。

1.1.2培養(yǎng)基。

慶大霉素瓊脂，用于霍亂弧菌的選擇性培養(yǎng)，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司。LB培養(yǎng)基和MH肉湯培養(yǎng)自己配置。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)。

將菌種O139群霍亂弧菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株MO45接種到LB液體培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)，接著接種到慶大霉素瓊脂選擇培養(yǎng)基，挑單菌落接種到5 ml肉湯培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h后的菌液用于試驗(yàn)。

1.2.2調(diào)配致病菌懸液。

將肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)的霍亂弧菌分別置于生理鹽水管中，充分混勻，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋s1×108 cfu/ml）和5.0麥?zhǔn)蠞岫龋?×109 cfu/ml）。

1.2.3

采取試管稀釋法確定中草藥紅茶菌的抑菌濃度。

每排安排6只2 ml的離心管，除每排第1支離心管外，每只離心管內(nèi)加已高壓滅菌的MH肉湯1 ml，每排的第1、2管分別加入2 ml受試物，依次對(duì)倍稀釋至第7管，此時(shí)試管里的紅茶菌制劑或中草藥紅茶菌制劑濃度依次是1∶1、1∶2、1∶4和1∶8，第6管作為測(cè)試菌生長(zhǎng)質(zhì)控，然后每管加入3.6 μl 0.5麥?zhǔn)蠞岫然?.0麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y(cè)試菌液，用振蕩器混合均勻，在37 ℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12 h后，取出一環(huán)接種慶大選擇培養(yǎng)基。根據(jù)是否有病原菌生長(zhǎng)，確定微生態(tài)制劑對(duì)測(cè)試菌的抑菌效果。

1.2.4共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅茶菌和中草藥紅茶菌體外抑制霍亂弧菌的影響研究。

每排安排5只2 ml離心管，每只離心管內(nèi)加1 ml紅茶菌原液、紅茶菌稀釋液、中草藥紅茶菌原液和稀釋液，然后每管加入3.6 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y(cè)試菌液，用振蕩器混合均勻，在37 ℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)1、2、4、8、12 h后，每個(gè)小時(shí)取出一環(huán)接種慶大選擇培養(yǎng)基。根據(jù)是否有病原菌生長(zhǎng)，確定共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)微生態(tài)制劑抑菌效果的影響。

1.2.5紅茶菌原液和中草藥紅茶菌原液對(duì)接種大劑量、高濃度霍亂弧菌的體外抑制作用的研究。

為了探索通過(guò)口服紅茶菌和中草藥紅茶菌預(yù)防霍亂弧菌感染的可能性，每排安排6只2 ml的離心管，每只離心管內(nèi)加1 ml紅茶菌原液、中草藥紅茶菌原液，然后每管加入5、10、20、50、100、200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y(cè)試菌液，用振蕩器混合均勻，在37 ℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12 h后，取出一環(huán)接種慶大選擇培養(yǎng)基。根據(jù)是否有病原菌生長(zhǎng)，確定微生態(tài)制劑的抑菌效果。

2結(jié)果與分析

2.1過(guò)濾滅菌的紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)接種低濃度霍亂弧菌的體外抑制作用

由表1可知，1 ml過(guò)濾滅菌的紅茶菌和中草藥紅茶菌菌液中接種3.6 μl麥?zhǔn)蠞岫?.50的霍亂弧菌，培養(yǎng)12 h后接種霍亂弧菌選擇性培養(yǎng)基，過(guò)濾滅菌的紅茶菌原液、1∶1、1∶2稀釋的過(guò)濾滅菌的紅茶菌原液都能有效抑制所添加的霍亂弧菌的生長(zhǎng)；過(guò)濾滅菌的中草藥紅茶菌原液、1∶1、1∶2、1∶4過(guò)濾滅菌的中草藥紅茶菌原液也都能有效抑制所添加的霍亂弧菌的生長(zhǎng)，其余處理包括對(duì)照都有霍亂弧菌生長(zhǎng)。這表明過(guò)濾滅菌的紅茶菌制劑以及1∶1、1∶2稀釋液能夠有效殺滅低濃度的霍亂弧菌，其余稀釋液不能完全殺滅低濃度的霍亂弧菌；相對(duì)于紅茶菌，過(guò)濾滅菌的中草藥紅茶菌的抑菌效果比相應(yīng)的紅茶菌制劑強(qiáng)1倍左右。

表1過(guò)濾滅菌紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)低濃度霍亂弧菌的體外抑制效果

類別稀釋比01∶11∶21∶41∶8CK

紅茶菌---+++++++++

中草藥紅茶菌----++++++

注：“-”表示霍亂弧菌顯色培養(yǎng)基中無(wú)霍亂弧菌生長(zhǎng)；“+++”表示霍亂弧菌顯色培養(yǎng)基中有大量霍亂弧菌生長(zhǎng)。

2.2紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)接種高濃度霍亂弧菌的體外抑制作用

由表2可知，1 ml紅茶菌和中草藥紅茶菌菌液及其稀釋液中接種3.6 μl麥?zhǔn)蠞岫?.0的霍亂弧菌，培養(yǎng)12 h后接種霍亂弧菌選擇性培養(yǎng)基，紅茶菌原液、1∶1、1∶2稀釋紅茶菌原液都能有效抑制所添加的高濃度霍亂弧菌的生長(zhǎng)；中草藥紅茶菌原液、1∶1、1∶2、1∶4的中草藥紅茶菌原液也都能有效抑制所添加的高濃度霍亂弧菌的生長(zhǎng)，其余處理包括對(duì)照都有霍亂弧菌生長(zhǎng)。這表明紅茶菌原液以及1∶1、1∶2稀釋液能夠有效殺滅高濃度的霍亂弧菌，其余稀釋液不能完全殺滅高濃度的霍亂弧菌；相對(duì)于紅茶菌，中草藥紅茶菌的抑菌效果比相應(yīng)的紅茶菌制劑強(qiáng)1倍左右。

表2紅茶菌和中草藥紅茶菌對(duì)高濃度霍亂弧菌的體外抑制效果

類別稀釋比01∶11∶21∶41∶8CK

紅茶菌---+++++++++

中草藥紅茶菌----++++++

注：“-”表示霍亂弧菌顯色培養(yǎng)基中無(wú)霍亂弧菌生長(zhǎng)；“+++”表示霍亂弧菌顯色培養(yǎng)基中有大量霍亂弧菌生長(zhǎng)。

2.3共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅茶菌和中草藥紅茶菌抑制霍亂弧菌效果的影響

由表3可知，共培養(yǎng)1 h后，即無(wú)霍亂弧菌生長(zhǎng)，表明紅茶菌制劑、中草藥紅茶菌制劑能快速殺滅或抑制霍亂弧菌的生長(zhǎng)。這也證明霍亂弧菌是對(duì)酸非常敏感的病原細(xì)菌。

表3共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)紅茶菌和中草藥紅茶菌制劑抑制霍亂弧菌效果的影響

類別共培養(yǎng)時(shí)間∥h124812

紅茶菌原液-----

1∶1稀釋紅茶菌液-----

1∶2稀釋紅茶菌液-----

中草藥紅茶菌原液-----

1∶1稀釋中草藥紅茶菌液-----

1∶2稀釋中草藥紅茶菌液-----

注：“-”表示霍亂弧菌顯色培養(yǎng)基中無(wú)霍亂弧菌生長(zhǎng)。

2.4紅茶菌原液和中草藥紅茶菌原液對(duì)接種大劑量、高濃度霍亂弧菌的體外抑制作用

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