汪春蕾，田菲，張?jiān)路f，孫鶴敏，李啟育，張凱鑫

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

染料的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被降解，成分復(fù)雜，酸堿性強(qiáng)，大多數(shù)具有芳環(huán)，已成為當(dāng)前最難處理的水體污染源之一。中國(guó)每年生產(chǎn)染料15萬(wàn)t 左右，其中有10%～15%排放到環(huán)境中，染料廢水已嚴(yán)重危害著人們的健康[1]。對(duì)廢水進(jìn)行物理和化學(xué)處理因費(fèi)用較高、耗時(shí)較長(zhǎng)、容易產(chǎn)生二次污染而受到限制[2]。對(duì)廢水進(jìn)行生物處理的環(huán)境相容性好，所以，生物處理廢水已成為了研究的熱點(diǎn)。漆酶(EC 1.10.3.2 p–diphenol: dioxygen oxidoreductases)是一種含銅的多酚氧化酶，可對(duì)氧化酚類和芳香族化合物進(jìn)行催化，并將分子氧還原成水[3–4]。漆酶的底物種類十分廣泛，在工業(yè)生產(chǎn)、生物技術(shù)領(lǐng)域及廢水治理方面都有著很好的應(yīng)用前景。漆酶在自然界中廣泛分布于植物、真菌和細(xì)菌中，但目前只有真菌漆酶被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[5]。自然界中的白腐菌是高效的產(chǎn)漆酶真菌，許多真菌漆酶已經(jīng)被分離和鑒定[6]。關(guān)于細(xì)菌漆酶的研究較少。盡管細(xì)菌漆酶的產(chǎn)率和氧化還原電勢(shì)均比真菌漆酶的低[7–8]，但與真菌漆酶相比，細(xì)菌漆酶在工業(yè)應(yīng)用中具有很多優(yōu)點(diǎn)。大多數(shù)細(xì)菌漆酶都有很好的耐熱性和耐堿性[9]，而真菌漆酶在高溫或極端條件下會(huì)迅速失去活性[6]。筆者從東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)白樺林下的土壤中篩選出1 株耐鹽高產(chǎn)漆酶的芽孢桿菌屬細(xì)菌，并對(duì)其生長(zhǎng)特性及其對(duì)常用紡織染料的脫色效果進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

土壤樣品采自東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)白樺林下。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

主要試劑Taq DNA polymerase、B 型小量DNA片段快速膠回收試劑盒、溶菌酶和E.coli JM109 為北京TIANGEN 公司產(chǎn)品；DNA Marker DL2 000、dNTP(2.5 mmol/L)、pMD18–T 載體為TaKaRa 公司產(chǎn)品；Tryptone、Yeast extract 為Oxoid 公司產(chǎn)品；瓊脂糖、EDTA、Tris–base 和SDS 是Amresco 公司產(chǎn)品；氨芐青霉素、丁香醛連氮(Syringaldazine)、結(jié)晶紫(CV)、靛紅(IC)、活性黑(RB5)和活性亮藍(lán)(RBBR)為Sigma 公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)，分析純。

LB 培養(yǎng)基中Tryptone、Yeast extract 、NaCl、Agar 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 10、5、10、17g/L，pH 為7.0。富集培養(yǎng)基中葡萄糖、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、NaCl、NH4Cl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4、12.8、3、0.5、1g/L。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)漆酶菌株的篩選與純化

菌株篩選與定性檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[10]。通過(guò)定性檢測(cè)得到對(duì)丁香醛連氮顯紅色的單個(gè)菌落。將所得到的菌落劃線接種于含0.4 mmol/L Cu2+的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3 d，并用1 mmol/L 丁香醛連氮溶液檢測(cè)單個(gè)菌落是否具有漆酶活性。重復(fù)上述操作2 ～3次。選取顯色較深紅的1 株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 所選取菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特性測(cè)定

對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，并測(cè)定其糖類發(fā)酵和明膠分解等方面的生理生化特性，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[11]。

1.2.3 所選取菌株的16S rDNA 序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

用SDS 法提取菌株的總DNA。以提取的菌株總DNA 為模板，利用16S rDNA 通用引物27F(5′–G AGTTTGATCMTGGCTCAG–3′，M=A+C)和1492R (5′–TACGGYTACCTTGTTACGACTT–3′，Y=C+T)[12]擴(kuò)增菌株的16S rDNA 序列。引物由華大基因公司合成。

PCR 反應(yīng)體系：2 μL10×Taq Buffer，1.6 μL dNTP，4 μL 上游引物(5 μmol/L)，4 μL 下游引物(5 μmol/L)，0.2 μL Taq DNA polymerase(3 U/μL)，0.5 μL DNA 模板，以ddH2O 補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為：93℃預(yù)變性5min，94℃變性18 s，56℃復(fù)性15 s，72℃延伸78 s，30次循環(huán)，72℃延伸7min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

以小量瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將膠回收產(chǎn)物與pMD18–T 連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將用菌落PCR 鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子送到華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)定結(jié)果在NCBI 的BLAST 上搜索比對(duì)，利用Bioedit 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用Phylip–3.69軟件中的遺傳距離法、Bootstrap 方法自展1 000次，構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 所選菌株的生物學(xué)特性研究

研究溫度、pH 值、鹽濃度以及Cu2+對(duì)菌株生長(zhǎng)特性的影響，取適量菌液接種于30mL LB 培養(yǎng)基中，分別讓菌株在不同條件下生長(zhǎng)，140 r/min 振蕩培養(yǎng)14 h，在分光光度計(jì)下測(cè)量其OD600nm，重復(fù)測(cè)量3次，結(jié)果取平均值。

1.2.5 所選菌株的芽孢漆酶對(duì)染料脫色效果的研究

將菌株接種于含0.2 mmol/L Cu2+的LB 固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)5 d，芽孢粗酶液的制備方法參照文獻(xiàn)[13]。

以丁香醛連氮作為底物檢測(cè)菌株芽孢漆酶的活性。反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度30℃，芽孢漆酶液10 μL， 0.2 mol/L 磷酸氫二鈉–0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液(pH 6.9) 2.9mL，1 mmol/L 的丁香醛連氮溶液0.3mL。以不加芽孢漆酶液的體系為空白對(duì)照。測(cè)定反應(yīng)3min 時(shí)的OD525nm。重復(fù)測(cè)定3次。丁香醛連氮的摩爾吸光常數(shù)為65 000 L/(mol·cm)。一個(gè)酶活單位定義為1min 內(nèi)氧化1 μmol 底物所需的酶量。

染料脫色體系：染料，芽孢漆酶液(終濃度為1mg/mL)，0.2 mol/L Na2HPO4–0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液(pH 7.0)?；钚粤了{(lán)、活性黑、靛紅和結(jié)晶紫的終質(zhì)量濃度分別為100、40、25、5mg/mL，最大吸收波長(zhǎng)分別為591、597、610、583 nm。以不加芽孢漆酶液的體系為空白對(duì)照。脫色反應(yīng)溫度為40℃，160 r/min 脫色，定時(shí)取樣，14 000 r/min 離心1min 后，用分光度計(jì)測(cè)定各種染料在其最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值，重復(fù)測(cè)定3次。染料脫色率的計(jì)算公式如下：染料的脫色率=(A0–A) /A0。A0為初始染料吸光值，A 為定期取樣時(shí)測(cè)定的染料吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)漆酶菌株的篩選與純化結(jié)果

將所采集的土壤樣品用富集培養(yǎng)基培養(yǎng)，以漆酶的特異性底物丁香醛連氮對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定，并利用Cu2+對(duì)菌株進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化，逐步提高Cu2+的濃度，最終得到產(chǎn)漆酶的純培養(yǎng)物，選取對(duì)丁香醛連氮顯紅色較深的1 株為研究菌株。

2.2 所選菌株的形態(tài)和生理生化特性

所選菌株經(jīng)革蘭氏染色后呈藍(lán)紫色，為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，短桿狀，有芽孢；使用LB 固體培養(yǎng)基，于 37℃培養(yǎng)24 h，觀察到菌落呈扁平狀，乳白色，表面干燥，菌落不透明，且正反面顏色一致。

所選菌株的生理生化特性見(jiàn)表1。該菌株能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖作為碳源，且具有氧化酶的活性。

表1 所選菌株的生理生化特性 Table 1 Physiological-biochemical characteristics of the selected strain

2.3 所選菌株的16S rDNA 序列分析結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹

所選菌株的16S rDNA PCR 結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，16S rDNA 擴(kuò)增條帶清晰，測(cè)序得到的結(jié)果為1 452 bp。在NCBI 中使用Blast 軟件進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，該菌株與多種芽孢桿菌的同源性達(dá)99%。參照此菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rDNA 同源性比對(duì)結(jié)果，鑒定該菌株為芽孢桿菌屬細(xì)菌，命名為Bacillus sp. 9BS。利用Bioedit 軟件對(duì)菌株9BS 的16S rDNA 序列進(jìn)行多序列比對(duì)，用Phyilp 軟件中的遺傳距離法構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

圖1 所選菌株的16S rDNA PCR 結(jié)果 Fig.1 PCR result for 16S rDNA of the selected strain

圖2 根據(jù)16S rDNA 序列分析構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2 Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence of the selected strain

2.4 菌株9BS 的生長(zhǎng)特性

菌株9BS 在25～42℃均能生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為37℃(圖3)。菌株9BS 在pH 5.0～9.0 時(shí)生長(zhǎng)良好，其最適生長(zhǎng)pH 值為7.0(圖4)。菌株9BS在7%NaCl 溶液中生長(zhǎng)良好，NaCl 濃度高于9 %時(shí)菌株生長(zhǎng)緩慢(圖5)，可見(jiàn)，菌株的耐鹽性比較好。Cu2+濃度對(duì)菌株9BS 的生長(zhǎng)影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基中含有0.2 mmol/L Cu2+時(shí)，菌株9BS 能夠生長(zhǎng)，隨著Cu2+濃度的升高，其生長(zhǎng)逐漸減慢(圖6)。

圖3 不同溫度下生長(zhǎng)菌株的OD600 nm Fig.3 OD600 nm of strain 9BSgrown under different temperatures

圖4 不同pH 下生長(zhǎng)菌株的OD600 nm Fig.4 OD600 nm of strain 9BSgrown under different pH values

圖5 不同濃度NaCl 下生長(zhǎng)菌株的OD600 nm Fig.5 OD600 nm of strain 9BSgrown under different concentrations of NaCl

圖6 不同濃度Cu2+下生長(zhǎng)菌株的OD600 nm Fig.6 OD600 nm of strain 9BSgrown under different concentrations of Cu2+

2.5 菌株9BS 芽孢漆酶對(duì)染料脫色的效果

以丁香醛連氮為底物，以芽孢干重計(jì)算，菌株9BS 芽孢漆酶的活性為47.1 U/g。在pH6.9，不加介體的條件下，菌株9BS 芽孢漆酶6 h 對(duì)活性亮藍(lán)、活性黑、靛紅和結(jié)晶紫的脫色率分別為35.1%、47.6%、73.3%和82.2%，對(duì)靛紅和結(jié)晶紫的脫色率較高(圖7)。

圖7 菌株9BS 芽孢漆酶在不同時(shí)間對(duì)4 種染料的脫色率 Fig.7 Decolorizations of 4 dyes at different times with spore laccase from strain 9BS

3 結(jié)論與討論

漆酶的活性中心由Cu2+組成，并且依賴Cu2+傳遞電子進(jìn)行氧化還原反應(yīng)。培養(yǎng)基中加入Cu2+可誘導(dǎo)漆酶的表達(dá)和提高漆酶活性[14–15]。本研究中利用含Cu2+的富集培養(yǎng)基從白樺林土壤中分離篩選出1 株具有漆酶活性的菌株9BS，并鑒定其為芽孢桿菌屬的細(xì)菌。菌株9BS 可以在pH 5.0～9.0 的環(huán)境下生長(zhǎng)，其芽孢漆酶的最適pH 值為7.0(真菌漆酶一般在pH 3.0～6.0 顯示活性[6])。

芽孢桿菌屬細(xì)菌的漆酶活性來(lái)源于芽孢外衣蛋白，芽孢產(chǎn)量對(duì)漆酶活性具有重要影響。在含Cu2+的LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株9BS，5 d 芽孢產(chǎn)量達(dá)到最高，以芽孢干重計(jì)，芽孢漆酶的酶活性達(dá)47.1 U/g，比Bacillus sp. CLb 芽孢漆酶活性高1 U/g[10]。由于芽孢需要制成懸液來(lái)測(cè)定其漆酶的活性，所以，以芽孢干重為基礎(chǔ)計(jì)算芽孢漆酶的活性，可以使不同細(xì)菌的芽孢漆酶之間具有可比性。

人工合成的染料已達(dá)到數(shù)千種[16]，它們一旦進(jìn)入自然環(huán)境中就很難被分解，并且許多染料對(duì)生物有毒害作用[17]。紡織業(yè)常用的染料依據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為漆酶底物類染料和非酶底物類染料。蒽醌類染料(如活性亮藍(lán))作為漆酶的底物可直接被氧化[18]。偶氮類(如活性黑)、靛青類(如靛紅)和三苯甲烷類染料(如結(jié)晶紫)不是漆酶底物，不能被漆酶催化，但在還原介體，如乙酰丁香酮(ACE)和1–羥基苯并三唑(HBT)等存在下，可介導(dǎo)漆酶與非酶底物染料之間的氧化作用[19]，增加對(duì)染料的脫色效果，菌株Bacillus sp. CLb 的芽孢漆酶在無(wú)介體參與下只能使活性亮藍(lán)和結(jié)晶紫脫色，在介體乙酰丁香酮(ACE)的作用下，其芽孢漆酶對(duì)活性亮藍(lán)、結(jié)晶紫、活性黑及靛紅4 種染料的脫色率均超過(guò)了70%[10]；云芝漆酶不能單獨(dú)作用于靛藍(lán)染料，需加入HBT 介體后才可以使靛藍(lán)染料脫色[20]。雖然漆酶–介體體系中的介體可提高染料脫色率，但價(jià)格昂貴，有毒性，穩(wěn)定性差，受pH 的影響大。菌株9BS 在不加介體的情況下能夠使染料靛紅(IC)和結(jié)晶紫(CV)在6 h 內(nèi)的脫色率分別達(dá)到73.3%和82.2%，可見(jiàn)菌株9BS 的漆酶具有與經(jīng)典漆酶(指真菌漆酶)不同的性質(zhì)，能夠在不加介體的情況下對(duì)靛藍(lán)和三苯甲烷類染料脫色。菌株9BS 在含7%NaCl 的環(huán)境下能正常生長(zhǎng)，表明其對(duì)鹽具有很強(qiáng)的耐受性(印染工業(yè)的廢水具有很高的鹽濃度)，所以，菌株9BS 的芽孢漆酶具有處理印染廢水的潛力。

綜合分析本研究結(jié)果，認(rèn)為在東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)白樺林土壤中分離出的菌株9BS 具有很好的耐鹽特性，其芽孢漆酶具有較高的活性，在不加介體的情況下能夠使靛紅和結(jié)晶紫脫色，在印染廢水的生物處理中具有一定的潛力。

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