張艷，曾東，倪學(xué)勤?，王劍，曾燕，簡平

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物微生態(tài)研究中心，四川 成都 611130；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

黃曲霉毒素(AF)是一類主要由黃曲霉菌、寄生曲霉菌、特異曲霉和假溜曲霉等產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)毒性，其中，以黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最強(qiáng)。黃曲霉毒素主要污染玉米、花生、堅(jiān)果等農(nóng)作物及其制品[1]。目前，肉雞感染黃曲霉毒素的檢測指標(biāo)主要有生長性能指標(biāo)、血清生化指標(biāo)、組織器官毒素殘留指標(biāo)等。1975年，Larsen 等[2]研究指出，經(jīng)AFB1處理后的倉鼠生長緩慢，并表現(xiàn)出AFB1毒性癥狀，腸道細(xì)菌數(shù)量下降。何明清等[3]指出，AFB11可抑制正常菌群的生長繁殖，引起機(jī)體菌群變化，在臨床上表現(xiàn)出一系列慢性中毒癥狀。

飼料中的黃曲霉毒素可經(jīng)堿處理、氧化處理、生物降解等多種方法去毒。近些年，生物降解法成了研究的熱點(diǎn)，許多微生物，包括細(xì)菌、酵母菌等都能吸附霉菌毒素。乳酸菌對(duì)AFB1吸附作用的研究始于1995年。目前，澳大利亞、日本和瑞典等國家開展這方面的研究較多。有研究[4]證明，乳酸菌屬的許多菌株都具有吸附黃曲霉毒素的作用。馬靜等[5]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可以減少人體腸道對(duì)黃曲霉毒素的吸收，增加毒素排泄。Lahtinen 等[6]證實(shí)，鼠李糖乳桿菌菌株GG(L. rhamnosus GG)能以物理結(jié)合方式除去培養(yǎng)介質(zhì)中的AFB1。筆者在含有50μg 黃曲霉毒素B1的飼料中加入不同含量的植物乳桿菌BS22，以研究BS22 對(duì)AFB1的吸附效果，并用含有AFB1和BS22 的飼料飼喂肉雞，采用PCR–DGGE 分析AFB1對(duì)肉雞腸道不同部位內(nèi)容物和黏膜中菌群的影響，探討B(tài)S22 對(duì)黃曲霉毒素的解毒作用及其對(duì)肉雞腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

供試AFB1含量大于99%，購自北京華安麥科有限責(zé)任公司；植物乳桿菌BS22 由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物微生態(tài)研究中心提供， 保貯編號(hào)為CCTCC:M2013010，活菌數(shù)為1.0×108CFU/mL。

試驗(yàn)動(dòng)物為1日齡健康艾維茵肉雞120 羽，體重45g 左右，購于溫江正大畜禽有限責(zé)任公司?；A(chǔ)日糧采用玉米–豆粕型飼料，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平 Table 1 Composition of basal diets and nutrient levels

1.2 基礎(chǔ)飼料添加BS22 對(duì)AFB1 的吸附試驗(yàn)(體外試驗(yàn))

試驗(yàn)設(shè)A、B、C、D、E 5個(gè)組，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 飼料添加BS22 試驗(yàn)設(shè)計(jì) Table 2 Experimental design of BS22 addition in feedstuff

分別于第0、15、30天時(shí)各采1次樣，每次混勻后采樣20g，放入樣品袋，編號(hào)，置于–20℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定不同時(shí)期飼料中AFB1的含量。檢測方法和具體操作步驟按照深圳綠詩源生物技術(shù)有限公司AFB1檢測ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)

選用1日齡健康艾維茵肉雞120 羽，隨機(jī)分為3個(gè)組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 羽。3個(gè)組之間初始體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。試驗(yàn)期為28 d。I組(對(duì)照組)，飼喂基礎(chǔ)日糧；II組，在基礎(chǔ)日糧中添加50 μg/kg AFB1；III組，在1 kg 基礎(chǔ)日糧中加 50 μg AFB1和 0.1%植物乳桿菌 BS22 (1×108CFU/g)。試驗(yàn)雞采用2 層籠養(yǎng)，自由飲水和采食，24 h 光照。

1.4 消化道各部位內(nèi)容物、黏膜采集及糞樣AFB1檢測

試驗(yàn)第28天采集供試雞的糞便，之后隨機(jī)從各組取肉雞5 只宰殺，采集消化道不同部位(嗉囊、腺胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸)內(nèi)容物，并將5 只雞相同部位的內(nèi)容物混合均勻，分裝至2mL離心管。同時(shí)采用無菌操作方法，在冰上用解剖刀將消化道黏膜刮下，置于裝有生理鹽水的離心管，振蕩均勻后各吸取5 只雞的混懸液200 μL 混合，分裝至2mL 離心管，–80℃保存。收集的糞樣按1.2 中的方法檢測ABF1含量。

參照文獻(xiàn)[7]提取細(xì)菌總DNA，用核酸濃度測定儀測定總DNA 濃度。

1.5 基因組總DNA 16S rDNA V3 區(qū)擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[8]中大腸桿菌16S rRNA基因V3片段(339 ～539 bp)設(shè)計(jì)引物：上游引物ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT–3'；下 游 引 物5'–GTAT TACCGCGGCTGCTGGCAC–3'。PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：上、下游引物(10 pmol/μL)各1.0 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，總DNA(模板)1.0～2.0 μL，用雙蒸水補(bǔ)至25 μL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照管。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物片段大小和濃度。

1.6 PCR–DGGE 分析

PCR–DGGE 分析參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。凝膠電泳梯度為35%～65%(100%的變性劑包括7 mol/L尿素和40%甲酰胺)，變性方向與電泳方向一致。采用l×TAE 作電泳緩沖液，100 V、60℃電泳14～16 h，結(jié)果經(jīng)硝酸銀染色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像。

1.7 割膠回收共性和特異性條帶并克隆和測序

將DGGE 圖譜上的共性和特異性條帶分別割膠回收并浸泡在100 μL 加有0.1%Triton X–100 的緩沖液中，4℃過夜，取l μL 作為模板，按1.5 中方法再次擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE 電泳，確認(rèn)回收片段的正確性。重復(fù)該過程，直至在DGGE 圖譜上得到單一的特定條帶為止。取l μL 回收純化的DNA 為模板，采用1.5 中方法擴(kuò)增V3區(qū)，不同的是使用不帶GC 發(fā)夾的引物，PCR 產(chǎn)物用于下一步克隆。

采用pMD19–T 載體試劑盒，參照使用手冊(cè)對(duì)模板PCR 產(chǎn)物進(jìn)行連接，再將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含氨芐青霉素的營養(yǎng)瓊脂平板，每條帶選取1～3個(gè)陽性克隆送英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司測序。應(yīng)用Chromas 2 軟件對(duì)測定序列進(jìn)行編輯，非嵌合體序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析，尋找親緣關(guān)系最近的細(xì)菌并克隆。

1.8 數(shù)據(jù)分析

將DGGE 圖譜數(shù)字化、標(biāo)準(zhǔn)化后得到1個(gè)記錄DGGE 膠中條帶遷移位置的數(shù)字化矩陣，將矩陣導(dǎo)入SPSS19 軟件和Quantity One 軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加BS22 對(duì)AFB1 含量的影響

由表3 可見，A組AFB1的含量極低，B組AFB1的含量與加入量相近。加入植物乳桿菌BS22 后，飼料中的AFB1含量顯著下降(P<0.05)，且隨著加入的植物乳桿菌活菌量的增加，飼料中AFB1的含量逐漸下降。同一添加量處理，隨飼料儲(chǔ)存時(shí)間的增加，B、C、D、E組ABF1含量均略有上升。

表3 飼料中AFB1 的含量 Table 3 The content of AFB1 in feedstuff

圖1 消化道內(nèi)容物細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)基因片段的PCR–DGGE圖譜和聚類結(jié)果 Fig.1 PCR–DGGE profiles and clustering results of 16S rDNA in V3 region from microbiota ingut content

2.2 飼料中添加BS22 對(duì)肉雞糞便中AFB1 含量的影響

I組(對(duì)照組)肉雞糞便中AFB1的殘留量為(0.579±0.025) μg/kg，II組(黃曲霉毒素組)肉雞糞便中AFB1的殘留量為(0.937±0.048) μg/kg，II組AFB1的殘留量顯著高于I組，而加入植物乳桿菌BS22 后，III組AFB1的殘留量為(1.587±0.055) μg/kg，顯著高于黃曲霉毒素組和對(duì)照組。上述結(jié)果表明，植物乳桿菌BS22 對(duì)AFB1有吸附作用，使得蓄積在動(dòng)物體內(nèi)的AFB1含量減少，而排出體外的AFB1含量增加。

2.3 消化道內(nèi)容物細(xì)菌16S rDNA V3 區(qū)基因片段的PCR–DGGE 圖譜和多樣性分析

圖1–a、b顯示，不同部位內(nèi)容物的細(xì)菌組成不一樣，其中盲腸中的細(xì)菌種類最豐富。對(duì)消化道內(nèi)容物而言，除回腸外，其他部位III組的細(xì)菌多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度均高于II組和對(duì)照組(表4)。由圖1– a、b聚類結(jié)果可知，除腺胃和盲腸外，II組與對(duì)照(I)組聚在一起，III組單獨(dú)存在；II組與對(duì)照組(I組)的最高相似性為87%，最低相似性為66%，而III組與對(duì)照組(I組)的最高相似性為79%，最低相似性為55%。

表4 消化道內(nèi)容物的細(xì)菌多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度 Table 4 Shannon–Wiener index (H'), evenness (EH) and richness (S) of microbiota ingut contents

2.4 肉雞消化道黏膜細(xì)菌16S rDNA V3 區(qū)基因片段的PCR–DGGE 圖譜和多樣性分析

消化道黏膜細(xì)菌16S rDNA V3 區(qū)基因片段的PCR–DGGE 圖譜見圖2。除空腸和盲腸外，其他部位II組的黏膜細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度均高于III組和對(duì)照組(I)，且III組和I組的多樣性指數(shù)相近或相同(表5)。由圖2–a、b 可以看出，不同部位黏膜的DGGE 圖譜條帶數(shù)有差異，盲腸依然菌群最豐富。由圖2–a、b 聚類結(jié)果可看出，III組與對(duì)照組(I組)大部分聚在一起，而II組單獨(dú)存在；III組與對(duì)照組的最高相似性為94%，最低相似性為62%，而II組與對(duì)照組的最高相似性為92%，最低相似性為63%。

圖2 消化道黏膜細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)基因片段的PCR–DGGE圖譜和聚類結(jié)果 Fig.2 PCR–DGGE profiles and clustering results of 16S rDNA in V3 region from microbiota ingut mucosa

表 5 消化道黏膜細(xì)菌的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度 Table 5 Shannon–Wiener index (H'), Evenness (EH) and Richness (S) of microbiota ingut mucosa

2.5 消化道各部位內(nèi)容物及黏膜的共性和特異性菌群分析

在DGGE 圖譜上共割膠回收19 條帶，其中有11 條共性條帶和8 條特異性條帶(圖l、圖2 中箭頭所指)。克隆測序后，在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)分析，找出了最相近的菌種(表6)。7個(gè)共性條帶為優(yōu)勢菌群，分別為卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、巴氏鏈球菌(Streptococcus pasteurianus) 、 食 淀 粉 乳 桿 菌(Lactobacillus amylovorus) 和 瑞 士 乳 桿 菌(Lactobacillus helveticus)。條帶1 和條帶7 分別是對(duì)照組肉雞腺胃和空腸內(nèi)容物的特異條帶，為未培養(yǎng)細(xì)菌；條帶10 和條帶11 為II組腺胃黏膜的特異性條帶，分別為未培養(yǎng)細(xì)菌和未培養(yǎng)的柔嫩梭菌屬(Uncultured Faecalibacterium sp.)；條帶12、14 和15 是II組十二指腸的特異條帶，其中條帶12 為梭菌屬(Clostridium sp.)，條帶14 為未培養(yǎng)的毛螺旋菌科(Uncultured Lachnospiraceae bacterium)。條帶17和19 是對(duì)照組和III組特有的條帶，分別是不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)和擬桿菌(Bacteroidetes bacterium)。

表6 DGGE共性條帶和特異性條帶的基因片段序列的BLAST分析 Table 6 BLAST analysis ofgenomic sequences in common bands and special bands in DGGE

3 結(jié)論與討論

Gong 等[10]曾提出5個(gè)以上的個(gè)體樣品混合才能代表整體的菌群組成。為減少個(gè)體差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，本試驗(yàn)中采取5 只雞相同部位的內(nèi)容物混合后提總DNA，在減少樣本數(shù)量的同時(shí)，保證了試驗(yàn)結(jié)果不受個(gè)體差異的影響。對(duì)消化道內(nèi)容物菌群而言，聚類結(jié)果是大部分腸段II組與對(duì)照組聚在一起，表明AFB1對(duì)內(nèi)容物菌群的作用不明顯。目前，有關(guān)毒素對(duì)腸道微生物種群及發(fā)酵影響的數(shù)據(jù)仍缺乏[11]。Sutic 等[12]研究指出，植物乳桿菌、干酪乳桿菌等可在AFB1的影響下利用葡萄糖等發(fā)酵產(chǎn)氣，但也未得到任何有意義的證據(jù)可證明AFB1對(duì)腸道菌群多樣性產(chǎn)生了影響。關(guān)于AFB1直接對(duì)黏膜菌群影響的研究目前尚少見報(bào)道，但其可引起黏膜損傷，間接影響腸道菌群結(jié)構(gòu)。Agag 等[13]和Ul–Hassan 等[14]分別證明AFB1可抑制機(jī)體自身的免疫力，導(dǎo)致寄生細(xì)菌和病毒感染宿主。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，除腺胃外，其他部位II組的菌群多樣性指數(shù)均高于對(duì)照組，可能是AFB1損傷黏膜組織，降低了腸道免疫功能，導(dǎo)致一些病原菌和寄生細(xì)菌的入侵，從而使黏膜細(xì)菌多樣性增加。Aboutalebi 等[15]研究指出，AFB1可引起十二指腸腸絨毛增生和黏膜的損傷。Fernandez 等[16]研究了 AFB1對(duì)羔羊回腸黏膜免疫分子細(xì)胞數(shù)量的影響，結(jié)果證明AFB1使回腸黏膜上的SIgA 細(xì)胞數(shù)量明顯減少。SIgA 是黏膜的主要免疫分子[17–18]，SIgA 的減少使回腸黏膜免疫系統(tǒng)受到損傷。Ramos 等[19]研究了AFB1在大鼠的小腸部位吸收的機(jī)制，結(jié)果表明AFB1高速通過小腸，幾乎可全部被腸道吸收，尤其在十二指腸的吸收效果最明顯。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，II組與對(duì)照組十二指腸段黏膜的菌群相似性相當(dāng)?shù)?，僅為63%，說明AFB1基本在十二指腸被吸收，并對(duì)黏膜菌群多樣性造成了較大的影響，故AFB1組(II組)與對(duì)照組的細(xì)菌多樣性存在較大差異。

本研究結(jié)果表明，III組大多數(shù)腸段內(nèi)容物的細(xì)菌多樣性指數(shù)高于對(duì)照組和II組， III組消化道各部位黏膜細(xì)菌多樣性指數(shù)和對(duì)照組的值相同或相近，說明飼喂植物乳桿菌BS22 可增加肉雞腸道微生物的數(shù)量和多樣性，這與郭元晟[20]的研究結(jié)果相似。El–Nezami 等[21]的研究證明了乳酸桿菌和丙酸菌屬可去除雞十二指腸的AFB1，并能在一定程度上改善由于AFB1引起的黏膜損傷，從而調(diào)整黏膜菌群趨于正常。

消化道內(nèi)容物不同部位條帶測序得到的優(yōu)勢菌群主要是乳桿菌，如唾液乳桿菌、嗜酸乳桿菌，該結(jié)果與潘康成等[24]的研究結(jié)果相似。對(duì)照組腺胃和空腸段特異條帶是未培養(yǎng)的微生物，而II組和III組在各腸段均無特異性條帶，進(jìn)一步說明AFB1對(duì)腸道內(nèi)容物菌群無明顯影響。黏膜各腸段測序結(jié)果顯示， II組有較多的特異條帶。有研究報(bào)道AFB1讓機(jī)體腸道組織中毒的機(jī)制包括抑制氧的產(chǎn)生[25]、抑制氧自由基[26]等，造成機(jī)體內(nèi)環(huán)境處于厭氧狀態(tài)。本研究中II組的特異性條帶12 和14 分別是梭菌屬(Clostridium sp.)和未培養(yǎng)毛螺菌科(Uncultured Lachnospiraceae bacterium)，前者是專性厭氧菌，后者是嚴(yán)格厭氧菌，表明AFB1可能如上述文獻(xiàn)報(bào)道，抑制了黏膜組織上氧的產(chǎn)生，使機(jī)體處于厭氧或嚴(yán)重厭氧狀態(tài)，從而使未培養(yǎng)毛螺菌科(Uncultured Lachnospiraceae bacterium)能在黏膜上定植，改變黏膜菌群結(jié)構(gòu)。

綜上所述，AFB1對(duì)肉雞腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)的作用不明顯，但其可引起黏膜損傷，從而導(dǎo)致黏膜菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。添加植物乳桿菌BS22 對(duì)AFB1引起的腸道黏膜菌群失調(diào)具有調(diào)節(jié)作用。

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