王民，馬照雨，王瑩，劉建新，韓學(xué)哲

·臨床論著·

整合素αvβ3抑制劑RGDfv對(duì)人骨肉瘤F5M2細(xì)胞系增殖及凋亡的影響

王民，馬照雨，王瑩，劉建新，韓學(xué)哲

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨外科，西安，710061）

目的 研究整合素αvβ3抑制劑RGDfv對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法 通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度RGDfv序列肽對(duì)F5M2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用；通過(guò)Western blot方法觀察經(jīng)RGDfv誘導(dǎo)48 h的F5M2細(xì)胞中凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度RGDfv序列肽處理的F5M2細(xì)胞增殖受到抑制，OD值明顯減少，并且呈濃度及時(shí)間依賴性（P<0.05 or 0.01）；RGDfv處理后的F5M2細(xì)胞中，隨著RGDfv濃度的升高，cleaved Caspase-3的表達(dá)量也較對(duì)照組明顯增加（P<0.05）。結(jié)論 RGDfv序列肽能抑制F5M2細(xì)胞的增殖，并通過(guò)依賴于Caspase-3的通路誘導(dǎo)骨肉瘤F5M2細(xì)胞凋亡。

骨肉瘤，整合素，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡

整合素是一類細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體家族分子，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管的形成[1]。整合素αvβ3在骨肉瘤中高表達(dá)，而在良性骨腫瘤及正常骨組織中不表達(dá)，抑制整合素αvβ3能否影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡還不清楚。

本試驗(yàn)研究整合素αvβ3抑制劑RGDfv序列肽對(duì)F5M2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用，并探索對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中凋亡因子caspase-3的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 成骨肉瘤細(xì)胞系F5M2由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨科中心暨全軍骨腫瘤研究所提供。

1.2 主要試劑及藥物 整合素αvβ3抑制劑RGDfv購(gòu)自Enzo life science公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物制品公司；胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone公司；Western blot試劑盒購(gòu)自西安晶彩生物科技有限公司；Caspase-3免抗人多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。其它生化試劑：青鏈霉素混合液、Tris堿、疊氮鈉、二甲苯、瓊脂、瓊脂糖、甲醇及異丙醇等為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分裝試劑。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn) 接種細(xì)胞：取指數(shù)生長(zhǎng)期的F5M2細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/ ml。接種于96孔板，每孔200 ul（約5×103個(gè)細(xì)胞）。待細(xì)胞完全貼壁后，更換含有不同濃度RGDfv的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分5組：RGDfv組，加200 ul含不同濃度RGDfv的培養(yǎng)液（20 ug/ml、30 ug/ml、40 ug/ml、50 ug/ml）；空白對(duì)照組，在200 ul DMEM培養(yǎng)液加入10 ul的PBS。每組5復(fù)孔。細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，加入20 ul的MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸取培養(yǎng)液，每孔加入150 ul DMSO溶解結(jié)晶，充分振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm的光吸收值（OD值）。

1.5 Western blot檢測(cè) caspase-3的表達(dá) 選擇RGDfv培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，取30 ug細(xì)胞總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，按濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到NC膜，5%脫脂奶粉4℃封閉2 h，滴加一抗（1：200）4℃過(guò)夜，選擇Tubulin作為內(nèi)參。TTBS洗膜10 min×4次，滴加二抗（1：3000）37℃孵育2 h，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行顯色，凝膠成像儀采集圖像，并運(yùn)用Image J圖像軟件計(jì)算灰度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差記錄，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同濃度的RGDfv對(duì)F5M2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 與對(duì)照組相比較，RGDfv對(duì)F5M2細(xì)胞具有抑制作用（P<0.05 or 0.01），而且其抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。不同濃度和不同時(shí)間的RGDfv處理對(duì)F5M2細(xì)胞OD值影響見(jiàn)圖1。

2.2 Western blot檢測(cè)F5M2細(xì)胞caspase-3的表達(dá)不同濃度RGDfv組的骨肉瘤細(xì)胞F5M2中，均有caspase-3的表達(dá)（圖2.A），且隨著RGDfv濃度的升高，cleaved Caspase-3的表達(dá)量也隨之增加（圖2. B）（P<0.05）。

圖1 不同濃度和不同時(shí)間的RGDfv處理對(duì)F5M2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 P<0.05，*P<0.01

圖2 Western blot檢測(cè)不同濃度RGDfv對(duì)F5M2細(xì)胞cleaved Caspase-3的表達(dá)的影響A：cleaved Caspase-3表達(dá)條帶，B：cleaved Caspase-3表達(dá)量統(tǒng)計(jì)柱形圖。

3 討論

整合素是一類細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體家族分子。對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附起介導(dǎo)作用。整合素所介導(dǎo)的粘附作用可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包含細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附與遷移、細(xì)胞增殖和淋巴細(xì)胞歸巢等。

整合素αvβ3在組織內(nèi)的分布具有時(shí)相性和特異性，在腫瘤新生血管及炎癥組織的血管新生內(nèi)皮細(xì)胞，整合素αvβ3有高水平表達(dá)；一些浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等也有整合素αvβ3的表達(dá)。早期的大量體外研究表明，整合素αvβ3對(duì)腫瘤新生血管具有促進(jìn)作用，通過(guò)抑制整合素功能可以明顯減少腫瘤新生血管的產(chǎn)生[2，3]。并且通過(guò)抑制整合素還對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生明顯的抑制。因此以整合素為靶點(diǎn)的腫瘤治療方法，成為了研究熱點(diǎn)。但是隨著整合素抑制劑逐步的進(jìn)入臨床試驗(yàn)后，研究者們發(fā)現(xiàn)，整合素抑制劑除了對(duì)少部分腫瘤起抑制作用（如對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤有明顯抑制作用[4-6]），目前沒(méi)用明確的證據(jù)表明其他類型的腫瘤也同樣有效[7-10]。因此以整合素αvβ3為靶點(diǎn)的治療方案還需進(jìn)一步的研究。整合素αvβ3在骨肉瘤中的研究主要集中在其對(duì)腫瘤血管的作用及其對(duì)腫瘤侵襲性的研究，而整合素αvβ3對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡影響的研究較少，因此本部分試驗(yàn)主要研究整合素αvβ3抑制劑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響。

本研究的MTT結(jié)果提示，用RGDfv抑制整合素αvβ3可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。在凋亡過(guò)程中，Caspase-3是關(guān)鍵的效應(yīng)分子。Caspase-3平時(shí)是以pro-Caspases-3這種未活化態(tài)的形式存在于細(xì)胞中，當(dāng)?shù)蛲鐾芳せ睿琾ro-Caspases-3可被切割形成cleaved caspase-3（17kD）活化形態(tài)。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)采用Western blot方法，檢測(cè)RGDfv處理48 h后細(xì)胞cleaved Caspase-3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在不同濃度RGDfv組的骨肉瘤細(xì)胞F5M2中，均有cleaved Caspase-3的表達(dá)，且在一定濃度條件下隨著RGDfv濃度的升高，cleaved Caspase-3的表達(dá)量也隨之增加。這些結(jié)果表明整合素αvβ3 RGDfv序列肽能抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，并通過(guò)依賴于Caspase-3的通路誘導(dǎo)骨肉瘤F5M2細(xì)胞凋亡。

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The effects of RGDfv-an inhibitor of integrin αvβ3 on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line F5M2

WANG Min，MA Zhao-yu，WANG-Ying，et al
（Department of Bone Surgery,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University College of Medicine，Xi'an,Shanxi 710061，China）

Objective To study the effects of RGDfv peptide，an inhibitor of integrinαvβ3，on proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells.Methods MTT method was used to explore the inhibitory effect of RGDfv on proliferation of osteosarcoma cells by comparing the OD values，and Western blot technology was used to detect the expression changes of cleaved Caspase-3 induced by RGDfv peptide with different concentrations.Results A concentration and temporal -dependent decreases of OD values in experimental cells with RGDfv peptide were demonstrated compared with control cells.（P<0.05 or 0.01）When compared with control，the expression of cleaved Caspase-3 increased significantly in cells with different concentrations of iRGDfv peptide （P<0.05）.Conclusion iRGDfv peptide could inhibit the proliferation of F5M2cells，and induce the apoptosis of F5M2cells by a Caspase-3 dependent pathway.

osteosarcoma；integrin；cell proliferation；apoptosis

R738

A

1005-7234（2015）05-0357-03

10.3969/j.jssn.1005-7234.2015.05.003

2014-12-01;

2015-02-09

陜西省自然科學(xué)基金(2012K13-02-25)

王民（1956-），男，陜西籍，主任醫(yī)師，教授

研究方向：骨關(guān)節(jié)病，骨腫瘤

韓學(xué)哲

電 話：13991117171

電子信箱:hanjianran@163.com