李鴻梅，趙 慧，魏 明，閔偉紅，張桂弘，劉景圣

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118)

羅爾阿太菌Athelia rolfsii 是擔(dān)子菌門阿太菌屬的一種真菌，無性世代為齊整小核菌，白色菌落，菌絲呈放射狀生長(zhǎng)，能分泌多糖［1-2］．該多糖是一種非離子型、水溶性的同聚多糖，包含β-D-(1→3)-吡喃葡萄糖基和β-D-(1→6)-吡喃葡萄糖基線性鏈［3-4］．具有水溶性、組織相容性、增稠性［5］、抗水解能力及在高溫下保持黏度的特性，廣泛應(yīng)用于食品［6］、藥品、石油采收、陶瓷、紙張、繪畫、化妝品、抗腫瘤、抗微生物及抗病毒等方面［7］．

目前羅爾阿太菌多糖的研究主要集中在多糖的物理化學(xué)特性、分子構(gòu)象、抗腫瘤活性、免疫活性及藥物緩釋方面［8-9］，但鮮見通過選育菌種提高產(chǎn)糖量的報(bào)道．原生質(zhì)體融合技術(shù)廣泛應(yīng)用于菌種選育，具有重組頻率高、遺傳物質(zhì)完善、易獲得性狀優(yōu)良的融合菌等優(yōu)點(diǎn)．陳合等［10］利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出高產(chǎn)靈芝多糖的靈芝菌;靳挺等［11］利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出高產(chǎn)茁霉多糖的出芽短梗霉．Gunashree 等［12］利用原生質(zhì)體融合技術(shù)成功地將黑曲霉和曲霉菌進(jìn)行了融合．本研究以菌株AY6657741為試驗(yàn)材料，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育多糖高產(chǎn)草酸低產(chǎn)的菌株，為提高多糖產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

羅爾阿太菌菌株AY6657741，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室分離和保藏．經(jīng)紫外和亞硝基胍復(fù)合誘變獲得突變菌株Ar-1 和Ar-2．

溶壁酶(≥200 U·mg－1)購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司;纖維素酶(≥10 000 U·mg－1)、蝸牛酶(≥2 000 U·mg－1)、KCl、NaCl，聚乙二醇(PEG)6000 等試劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司．

PDA 斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，121 ℃滅菌20 min．

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，酵母浸粉1.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaNO33.0 g，KCl 0.5 g，加蒸餾水定容至1 L，pH 4.55，121 ℃滅菌20 min．

發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉35 g，玉米黃漿50 mL，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaNO33.1 g，KCl 0.5 g，檸檬酸0.4 g，加蒸餾水定容至1 L，pH 4.55，121 ℃滅菌20 min．

低滲培養(yǎng)基:蛋白胨5.0 g，瓊脂15 g，牛肉浸膏3.0 g，葡萄糖10 g，酵母浸粉1.0 g，馬鈴薯200 g，蒸餾水定容到1 L，pH 4.55，121 ℃滅菌20 min．

雙層再生培養(yǎng)基:低滲培養(yǎng)基中加入滲透壓穩(wěn)定劑(0.4 mol·L－1的KCl、NaCl、蔗糖、MgSO4)［13］，上層瓊脂15 g，下層瓊脂5 g，pH 4.55，121 ℃滅菌20 min．

1．2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將A．rolfsii AY6657741 菌株接種于250 mL 種子培養(yǎng)基中，29 ℃、200 r·min－1空氣浴振蕩培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為7%，29 ℃、200 r·min－1培養(yǎng)162 h．期間每6 h 取出3 瓶培養(yǎng)基，分別用HCl 調(diào)節(jié)pH 至7.0，用蒸餾水稀釋3 倍，8 000 r·min－1離心15 min．棄上清液留菌絲體，80 ℃烘干菌絲體至恒質(zhì)量，稱菌絲體干質(zhì)量，獲得菌體生長(zhǎng)曲線．

1．3 菌懸液的制備

取斜面培養(yǎng)菌株，無菌水沖洗，渦旋器振蕩混勻，用無菌擦鏡紙濾去菌絲體片段，用無菌水稀釋至終濃度為1.0×105mL－1，轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基中，29℃、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)55 h［14］．

1．4 原生質(zhì)體制備及條件

1．4．1 原生質(zhì)體制備與再生 取培養(yǎng)55 h 的種子發(fā)酵液9 mL，取1 mL 涂布于PDA 培養(yǎng)基上，29℃條件下培養(yǎng)．其余8 mL 菌懸液中加入1 mL 5.56 mmol·L－1的β-巰 基 乙 醇，靜 置30 min．6 500 r·min－1離心15 min，棄上清液留菌絲體，滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2 次．加入1 mL 的酶液，32 ℃條件下60 r·min－1振蕩酶解，滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2 次，去酶液，6 500 r·min－1離心15 min，棄上清液留原生質(zhì)體．原生質(zhì)體保存于滲透壓穩(wěn)定劑中，取1 mL 涂布于低滲培養(yǎng)基，1 mL 涂布于雙層再生培養(yǎng)基上，29 ℃條件下培養(yǎng)．按公式計(jì)算原生質(zhì)體的形成率和再生率．

式中，SA、SB、SC分別為PDA 培養(yǎng)基、低滲培養(yǎng)基、雙層再生培養(yǎng)基上的菌落面積(cm2)．

1．4．2 原生質(zhì)體制備條件的選擇 破壁酶:選用培養(yǎng)55 h 的菌懸液，0.4 mol·L－1的KCl 作為高滲穩(wěn)定劑，3.1 mg·mL－1的酶，32 ℃酶解55 min，分別選擇7 組酶進(jìn)行單因素試驗(yàn)．其中，第1 組為纖維素酶(pH 5.0)，第2 組為蝸牛酶(pH 5.8)，第3 組為溶壁酶(pH 5.4)，第4 組為復(fù)合酶(纖維素酶φ 為2%、蝸牛酶φ 為4%、溶壁酶φ 為2%，pH 5.5)，第5 組為復(fù)合酶(纖維素酶φ 為2%、蝸牛酶φ 為2%、溶壁酶φ 為4%，pH 5.5)，第6 組為復(fù)合酶(纖維素酶φ為4%、蝸牛酶φ 為2%、溶壁酶φ 為2%，pH 5.5)，第7 組為復(fù)合酶(纖維素酶φ 為2%、蝸牛酶φ 為2%、溶壁酶φ 為2%，pH 5.5)．

酶濃度:選用培養(yǎng)55 h 的菌懸液，0.4 mol·L－1的KCl 作為高滲穩(wěn)定劑，分別選擇1.3、2.2、3.1、4.0、4.9 和5.8 mg·mL－1的第5 組復(fù)合酶，32 ℃條件下酶解55 min，進(jìn)行單因素試驗(yàn)．

酶解溫度:選用培養(yǎng)55 h 的菌懸液，0.4 mol·L－1的KCl 作為高滲穩(wěn)定劑，3.1 mg·mL－1的第5 組復(fù)合酶酶解55 min．分別選擇26、28、30、32、34 和36 ℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)．

酶解時(shí)間:選用培養(yǎng)55 h 的菌懸液，0.4 mol·L－1的KCl 作為高滲穩(wěn)定劑，3.1 mg·mL－1的第5 組復(fù)合酶32 ℃條件下分別振蕩酶解25、35、45、55、65、75和85 min 進(jìn)行單因素試驗(yàn)．

pH:選用培養(yǎng)55 h 的菌懸液，0.4 mol·L－1的KCl 作為高滲穩(wěn)定劑，3.1 mg·mL－1的復(fù)合酶(纖維素酶φ 為2%、蝸牛酶φ 為2%、溶壁酶φ 為4%)32℃酶解55 min．pH 分別選擇3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5 進(jìn)行單因素試驗(yàn)．

滲透壓穩(wěn)定劑:選用培養(yǎng)55 h 的菌懸液，3.1 mg·mL－1的第5 組復(fù)合酶，32 ℃酶解55 min．分別選擇0.4 mol·L－1的NaCl、蔗糖、KCl、MgSO4進(jìn)行單因素試驗(yàn)．

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以原生質(zhì)體形成率和再生率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)L16(45)(表1)確定原生質(zhì)體制備的最佳條件．

表1 原生質(zhì)體制備正交試驗(yàn)因素水平表Tab．1 Protoplast preparation orthogonal factor level table

1．5 原生質(zhì)體紫外滅活和熱滅活

將制備好的Ar-1 和Ar-2 原生質(zhì)體懸浮液等體積混合，均分為2 份，記為Ⅰ和Ⅱ，Ⅰ用于紫外滅活，Ⅱ用于熱滅活．

從Ⅰ中取1 mL 涂布于雙層再生培養(yǎng)基上，29 ℃條件下培養(yǎng)．余下部分均分為6 組，分別在紫外光下滅活1、3、5、7、9 和11 min，各取1 mL 涂布于再生雙層培養(yǎng)基上，29 ℃避光培養(yǎng)．

從Ⅱ中取1 mL 涂布于雙層再生培養(yǎng)基上，29 ℃條件下培養(yǎng)．余下部分均分為21 組，分別于45、55和65 ℃的恒溫水浴鍋中保溫15、25、35、45、55、65 和75 min，各取1 mL 涂布于再生雙層培養(yǎng)基上，29 ℃條件下培養(yǎng)．按公式計(jì)算原生質(zhì)體滅活率．

式中，SU表示未經(jīng)紫外和熱滅活的再生菌落面積(cm2)，ST表示經(jīng)紫外和熱滅活后的再生菌落面積(cm2)．

1．6 原生質(zhì)體融合

1．6．1 原生質(zhì)體融合 分別取“1.5”中不同方法滅活的原生質(zhì)體懸液，等體積混合均勻，6 500 r·min－1離心15 min，棄上清液留原生質(zhì)體．加入PEG6000 促融，30 ℃水浴處理，不同時(shí)間段取出．0.4 mol·L－1的KCl 洗滌2 次，去除PEG6000，重懸于KCl 中，取1 mL 涂布于再生雙層培養(yǎng)基上，29 ℃培養(yǎng)，按公式計(jì)算原生質(zhì)體的融合率．

式中，SR、SU分別表示融合子菌落面積和未滅活的原生質(zhì)體再生菌落面積(cm2)．

1．6．2 原生質(zhì)體融合條件的選擇 PEG6000 濃度:向2 mL 滅活后的原生質(zhì)體懸液中分別加入4 mL 0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 和0.50 g·mL－1的PEG6000 在30 ℃條件下融合25 min．

融合時(shí)間:向2 mL 滅活后的原生質(zhì)體懸液中分別加入4 mL 0.4 g·mL－1的PEG6000，在30 ℃條件下分別融合10、15、20、25、30 和35 min．

融合溫度:向2 mL 滅活后的原生質(zhì)體懸液中分別加入4 mL 0.4 g·mL－1的PEG6000 分別在26、28、30、32、34 和36 ℃條件下融合25 min．

1．7 融合子的篩選

再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出融合子后，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的融合子傳代5 次，劃線法接種于PDA 斜面培養(yǎng)基上，29 ℃條件下培養(yǎng)．轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基中，29 ℃、200 r·min－1空氣浴振蕩培養(yǎng)．再轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為7%，29 ℃、200 r·min－1空氣浴振蕩培養(yǎng)5.5 d．測(cè)定發(fā)酵液中多糖及草酸產(chǎn)量，最終篩選出1株多糖產(chǎn)量高且草酸產(chǎn)量低的融合菌株．多糖含量的測(cè)定采用蒽酮硫酸法［15］，草酸含量的測(cè)定采用分光光度法［16-17］．

2 結(jié)果與分析

2．1 羅爾阿太菌生長(zhǎng)曲線

通過測(cè)定菌體生長(zhǎng)曲線得知30～80 h 菌體生長(zhǎng)旺盛，為羅爾阿太菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)制備原生質(zhì)體，可得到較高的原生質(zhì)體形成率和再生率［18］．因此選用培養(yǎng)55 h 的菌體用于原生質(zhì)體制備．

2．2 原生質(zhì)體制備條件

2．2．1 制備條件對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響 由圖1a 可知在添加單一種類酶中，第3 組溶壁酶的去壁和再生效果最好，原生質(zhì)體的形成率為71.343%，再生率為9.003%．而第1 組纖維素酶和第2 組蝸牛酶的形成率和再生率都偏低．第4、5、6和7 組復(fù)合酶的形成率和再生率都高于單一酶，尤其是第5 組復(fù)合酶原生質(zhì)體的形成率為92.765%，再生率為18.869%，效果最好．

由圖1b 可知隨著復(fù)合酶濃度的增加，原生質(zhì)體的形成率逐漸增加，再生率逐漸降低．原因可能是隨著復(fù)合酶濃度的增加，細(xì)胞壁與酶分子接觸機(jī)會(huì)增加，細(xì)胞壁被酶解的幾率增大，因此形成率增大．但當(dāng)復(fù)合酶濃度過高時(shí)，不僅細(xì)胞壁被酶解，細(xì)胞膜也遭到嚴(yán)重破壞，致使原生質(zhì)體再生困難，造成再生率下降．當(dāng)復(fù)合酶為3.1 mg ·mL－1時(shí)，原生質(zhì)體的形成率為93.133%，再生率為18.932%，綜合效果較好．

由圖1c 可知當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，原生質(zhì)體的形成率最高，為92.767%．當(dāng)溫度為32 ℃時(shí)，原生質(zhì)體再生率最高．這是由于酶在其最適溫度下才能發(fā)揮最高活力，溫度低，只能酶解部分細(xì)胞壁，原生質(zhì)體形成率和再生率都不高．溫度高不利于原生質(zhì)體的形成，導(dǎo)致形成率和再生率下降．考慮到原生質(zhì)體再生是原生質(zhì)體滅活的關(guān)鍵，溫度采用32 ℃．

由圖1d 可知隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體形成率逐漸提高，而再生率逐漸下降．原因可能是酶解時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞壁被水解的越完全，使原生質(zhì)體形成率提高，但酶解時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，酶在酶解細(xì)胞壁的同時(shí)也會(huì)損傷細(xì)胞膜，使原生質(zhì)體再生困難，導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率下降，當(dāng)酶解時(shí)間為55 min 時(shí)，原生質(zhì)體形成率為92.134%，再生率為17.332%，綜合效果較好．

由圖1e 可知，pH 5.5 時(shí)原生質(zhì)體的形成率和再生率均達(dá)最大值．這可能是由于pH 5.5 處于蝸牛酶(5.0～5.8)、纖維素酶(4.0～5.5)、溶壁酶(5.4～6.0)的適宜范圍內(nèi)，酶解效果好，因此原生質(zhì)體形成率和再生率最高．

圖1 制備條件對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響Fig．1 Effects of preparation conditions on the formation and regeneration rates of protoplast

由圖1f 可知KCl 作為滲透壓穩(wěn)定劑破壁效果均優(yōu)于MgSO4、NaCl 和蔗糖，原生質(zhì)體形成率和再生率分別為93.501%和18.867%．利用spss16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明Sig 為0.000，差異極顯著，按照顯著性水平P＜0.05 分成3 列(KCl、NaCl和蔗糖、MgSO4)，三者之間有著顯著差異，其中NaCl和蔗糖之間差異不顯著．這可能是由于KCl 作為滲透壓穩(wěn)定劑更易避免原生質(zhì)體膨脹破裂．因此采用KCl 作為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行原生質(zhì)體制備．

2．2．2 原生質(zhì)體制備最佳條件的選擇 原生質(zhì)體制備正交試驗(yàn)結(jié)果見表2．由表2 可以看出，極差R的分布大小依次為復(fù)合酶濃度(A)＞酶解時(shí)間(C)＞酶解溫度(B)＞滲透壓穩(wěn)定劑(E)＞pH(D)．這表明復(fù)合酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率影響最大，pH 影響最小．原生質(zhì)體制備最佳組合條件為A2B2C3D2E3，即0.4 mol·L－1的KCl 作為滲透壓穩(wěn)定劑，復(fù)合酶3.1 mg·mL－1，pH 5.5、32 ℃條件下酶解55 min，原生質(zhì)體形成率為93.534%，再生率為18.921%．

表2 原生質(zhì)體制備正交試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 The results of protoplast preparation orthogonal test

2．3 紫外滅活和熱滅活對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響

紫外滅活和熱滅活對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響如圖2 所示，由圖2a 可以看出隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體致死率升高．紫外照射5 min，原生質(zhì)體致死率達(dá)98.6%，照射6 min，原生質(zhì)體致死率達(dá)100%，因此6 min 為紫外滅活最佳時(shí)間．

由圖2b 可以看出，45 ℃熱處理60 min，55 ℃熱處理55 min，65 ℃熱處理40 min，原生質(zhì)體致死率均達(dá)100%．為了在最短時(shí)間內(nèi)達(dá)到滅活目的，選擇65℃熱處理40 min．

2．4 融合條件對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響

融合條件對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響見圖3，由圖3a 可以看出，隨著PEG6000 濃度的增加，原生質(zhì)體融合率先增加后降低．當(dāng)PEG6000 為0.4 g·mL－1時(shí)，原生質(zhì)體融合率為6.792%．原因可能是PEG6000在原生質(zhì)體融合過程中既作為誘導(dǎo)劑又作為穩(wěn)定劑，濃度低時(shí)誘導(dǎo)作用不明顯，濃度高時(shí)原生質(zhì)體不穩(wěn)定易破裂，致使原生質(zhì)體融合率降低．

圖2 紫外滅活和熱滅活對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響Fig．2 Effects of UV-inactivated and heat-inactivated treatments on death rate of protoplasts

由圖3b 可以看出，隨著融合時(shí)間的增加，原生質(zhì)體融合率先增加后降低．當(dāng)融合時(shí)間為25 min 時(shí)，原生質(zhì)體融合率為6.543%．可能原因是融合時(shí)間短，原生質(zhì)體融合不完全．融合時(shí)間長(zhǎng)，PEG6000 會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒害作用，致使原生質(zhì)體融合率降低．

由圖3c 可以看出，隨著融合溫度的增加，原生質(zhì)體融合率先增加后降低．當(dāng)融合溫度為30 ℃時(shí)，原生質(zhì)體融合率為6.452%．原因可能是融合溫度低時(shí)達(dá)不到融合條件，融合溫度高時(shí)抑制PEG6000 作用，致使原生質(zhì)體融合率降低．

圖3 融合條件對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響Fig．3 Effects of fusion conditions on protoplast fusion rates

2．5 融合子的篩選

2．5．1 原生質(zhì)體融合子形態(tài) 原生質(zhì)體融合子形態(tài)見圖4，原生質(zhì)體經(jīng)紫外和熱處理滅活后，致死率為100%，在雙層再生培養(yǎng)基上不再生長(zhǎng)．原生質(zhì)體融合后在再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出融合子，最初是1 個(gè)白色圓形的點(diǎn)，隨后菌絲向外萌發(fā)生長(zhǎng)，通常需要6～9 d．

圖4 原生質(zhì)體融合子形態(tài)Fig．4 The form of protoplast fusant

2．5．2 篩選菌株多糖及草酸含量 經(jīng)原生質(zhì)體融合篩選出了4 個(gè)菌株，分別命名為AY-1、AY-2、AY-3、AY-4，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5.5 d 后測(cè)得多糖及草酸產(chǎn)量見表3．

表3 篩選菌株的多糖和草酸產(chǎn)量1)Tab．3 Polysaccharide and oxalic acid yields of screened strains ρ/(g·L －1)

1)表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)，同列數(shù)據(jù)后凡是有一個(gè)相同小寫字母者，表示差異不顯著(Duncan’s 法，P＞0.05)．

由表3 可以看出，經(jīng)原生質(zhì)體融合選育的菌株中，除菌株AY-1 的多糖產(chǎn)量下降外，其他菌株多糖產(chǎn)量都高于Ar-1 和Ar-2，菌株AY-3 和AY-4 多糖產(chǎn)量較高，分別比原始菌株的產(chǎn)糖量提高了54.42%和45.18%．此外，菌株AY-3 草酸產(chǎn)量最低，為0.281 g·L－1，比原始菌株的草酸產(chǎn)量降低了43.57%．菌株AY-1、AY-2、AY-3、AY-4 多糖產(chǎn)量均與原始菌株差異顯著(P＜0.05)．草酸產(chǎn)量除菌株AY-4 與原始菌株差異不顯著外(P＞0.05)，菌株AY-1、AY-2、AY-3 均與原始菌株差異顯著(P＜0.05)．菌株AY-3 的多糖產(chǎn)量、多糖產(chǎn)量變化、草酸產(chǎn)量、草酸產(chǎn)量變化均與其他菌株差異顯著(P＜0.05)，為最佳產(chǎn)糖菌株．

3 討論與結(jié)論

真菌原生質(zhì)體融合技術(shù)不僅打破了微生物種界界限，還能保持完整的遺傳物質(zhì)，從而完成菌株基因重組，重組后的融合子具有雙親遺傳性狀，能夠表現(xiàn)出雙親的優(yōu)良性狀．本研究中以羅爾阿太菌菌株AY6657741 為原始菌株，誘變株Ar-1 和Ar-2 為雙親菌株，以玉米淀粉和玉米黃漿為培養(yǎng)基，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育的羅爾阿太菌菌株多糖產(chǎn)量高達(dá)24.673 g·L－1．本試驗(yàn)中多糖產(chǎn)量與Shrikant 等［19］的研究相比，產(chǎn)糖量提高了10.54%．這表明原生質(zhì)體融合技術(shù)能較好地提高羅爾阿太菌分泌多糖的能力，為今后進(jìn)一步提高多糖產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)．

本試驗(yàn)中采用紫外照射和熱處理方法滅活雙親原生質(zhì)體，但紫外處理和熱處理在一定條件下有可逆性，因此融合培養(yǎng)后的菌株具有不穩(wěn)定性，其性狀特征可能很快失去，所以必須傳代數(shù)次保證其性狀的穩(wěn)定性．另外在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，伴隨多糖的產(chǎn)生，會(huì)生成草酸，使發(fā)酵液pH 由4.55 很快降至2.00左右，從而抑制了多糖的分泌，當(dāng)草酸產(chǎn)量高于0.368 g·L－1時(shí)，多糖產(chǎn)量就會(huì)受到影響．采用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出的菌株AY-3 滿足了草酸低產(chǎn)，多糖高產(chǎn)的要求．

目前高產(chǎn)羅爾阿太菌多糖生產(chǎn)專利技術(shù)由Cargill 公司擁有，我國(guó)只能依賴進(jìn)口．本研究中獲得的菌株AY-3 可為我國(guó)獲得擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的羅爾阿太菌多糖工藝技術(shù)奠定了一定的理論基礎(chǔ)．今后的研究將進(jìn)一步探討AY-3 生產(chǎn)多糖的工藝，以期為該糖工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)．

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