武明珠，許亞龍，李鋒，魏攀，王中，羅朝鵬，王燃，張劍鋒，林福呈，楊軍

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

煙草綠原酸合成關(guān)鍵基因NtHQT1的克隆及表達(dá)分析

武明珠，許亞龍，李鋒，魏攀，王中，羅朝鵬，王燃，張劍鋒，林福呈，楊軍*

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

綠原酸（Chlorogenic acid，CGA）是煙葉中含量最高的多酚類物質(zhì)，羥基肉桂酰輔酶A奎尼羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT）是植物綠原酸合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶。為研究HQT基因在煙草綠原酸合成中的作用機(jī)制，通過(guò)同源克隆技術(shù)從煙草中克隆到一個(gè)新的HQT基因，命名為NtHQT1。生物信息學(xué)和激素處理后基因表達(dá)模式分析結(jié)果表明:NtHQT1 cDNA全長(zhǎng)1 305 bp，編碼435個(gè)氨基酸，NtHQT1定位在細(xì)胞質(zhì)中，屬于疏水性蛋白，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲；茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）、生長(zhǎng)素（3-Indoleacetic acid，IAA）、獨(dú)角金內(nèi)酯類似物（GR24）、細(xì)胞分裂素（6-Benzylaminopurin，6-BA）和赤霉素（Gibberellic acid，GA）能明顯上調(diào)NtHQT1基因的表達(dá)，脫落酸（Abscisic acid，ABA）對(duì)基因表達(dá)沒(méi)有明顯作用，預(yù)示NtHQT1基因在煙草生長(zhǎng)發(fā)育和抗病等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

煙草；綠原酸；NtHQT1；克隆；序列分析；表達(dá)分析

綠原酸（Chlorogenic acid，CGA），又名咖啡單寧，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗抑郁等藥理學(xué)作用［1-3］。綠原酸可以被小腸直接吸收，或是經(jīng)過(guò)大腸的菌群水解后變成咖啡酸（Caffeic acid）［4-6］，咖啡酸和綠原酸均具有較強(qiáng)的抗氧化能力［7］。有研究發(fā)現(xiàn)綠原酸清除自由基的能力明顯高于經(jīng)典的抗氧化劑抗壞血酸［8-9］。綠原酸在一些中藥材如金銀花、杜仲等中含量較高，也是煙葉中含量最高的多酚類化合物，約占總多酚含量的70%～90%［10］。

綠原酸是植物體在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，其合成受多種因素的影響。有研究發(fā)現(xiàn)光照強(qiáng)度影響綠原酸在植物葉片中的積累，冬季生長(zhǎng)在光照充足條件下的葉片中綠原酸含量較背陰條件下明顯增高；夏季葉片中的綠原酸含量則比冬季增高一倍［8］。另外還發(fā)現(xiàn)一些病原菌侵染能提高植物綠原酸含量，當(dāng)煙草遭受根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）侵染時(shí)根和葉中的綠原酸含量明顯增高［11］。稻瘟病菌絲和培養(yǎng)濾液中的提取物處理水稻和水稻愈傷組織都能誘導(dǎo)綠原酸的生物合成［12］，這可能與綠原酸能提高植物的抗病性有關(guān)。此外有研究發(fā)現(xiàn)植物在缺硼條件下綠原酸的合成顯著增加［13］。羥基肉桂酰輔酶A奎尼羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT）是綠原酸合成代謝途徑的關(guān)鍵酶。敲除HQT基因能夠顯著降低煙草綠原酸含量，在番茄中HQT基因過(guò)表達(dá)，則綠原酸含量明顯上升［14］。目前對(duì)于煙草綠原酸的合成代謝途徑研究較少，為此，在普通煙草紅花大金元中克隆到了NtHQT1基因，對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，并研究了不同激素處理對(duì)基因表達(dá)的影響，旨在為揭示煙草綠原酸的合成代謝途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙草材料

普通煙草（Nicotiana tabacum）紅花大金元種植于國(guó)家煙草基因研究中心的人工氣候溫室，采集移栽后4周的煙草幼苗用于HQT1基因克隆。另選取移栽后4周的煙苗分別用10μmol/L脫落酸（Abscisicacid，ABA）、50μmol/L赤霉素（Gibberellic acid，GA）、100μmol/L茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）、10μmol/L獨(dú)角金內(nèi)酯類似物（GR24）、5μmol/L 3-吲哚乙酸（3-Indoleacetic acid，IAA）和10μmol/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurin，6-BA）激素溶液對(duì)煙苗進(jìn)行噴霧處理；對(duì)照則采用等體積的雙蒸水（CK）。均勻噴灑煙草葉片，以葉片均勻附著一層小水珠為準(zhǔn)。每處理設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的重復(fù)，每重復(fù)為3株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗；每種激素處理后單獨(dú)放置，避免激素間產(chǎn)生交叉作用，在激素處理8 h后采樣用于基因表達(dá)模式分析。

1.2 煙草總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德來(lái)生物科技有限公司）提取不同處理煙草總RNA，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書。利用DNA酶（DNase I）去除RNA中殘留的少量DNA。提取出的煙草不同處理的RNA，采用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技有限公司）測(cè)定OD230、OD260和OD280值并計(jì)算濃度，同時(shí)用2100生物分析儀（美國(guó)安捷倫公司）測(cè)定RNA的完整性。選擇純度高、完整性好的總RNA用于cDNA第Ⅰ鏈的合成，具體步驟參照PrimeScript?Reverse Transcriptase（［寶生物工程（大連）有限公司］）試劑盒說(shuō)明書。

1.3 基因全長(zhǎng)克隆

以煙草及茄科植物馬鈴薯和番茄的HQT全長(zhǎng)cDNA序列為探針，在NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，對(duì)查找到的普通煙草EST序列進(jìn)行拼接比對(duì)。然后再用拼接的基因序列在GeneBank中進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)與其他同源物種的相似度和一致性確定片段的正確性和編碼序列的完整性。并根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，上游引物：5′-ATGAGGATCAATATTAAGGAAT-3′，下游引物：5′-AAATTCATACAAGTACTTCTCA-3′，并由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25μL，包括ddH2O 9.7 μL、PremixTaq 12.5 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL和cDNA 2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60～90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫。

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］回收目的片段；用純化回收的目的片段連接pMD19-T載體，4℃過(guò)夜，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取白色單菌落，37℃控溫?fù)u床搖菌12 h左右（200 r/min）；以微量菌液為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證是否為陽(yáng)性克隆。含有目的片段的重組質(zhì)粒由北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

對(duì)獲得的HQT1基因序列用ProtParam軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）分析NtbHLH93蛋白中各種氨基酸含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），并預(yù)測(cè)理論分子量和等電點(diǎn)；TMHMM Server（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析其跨膜結(jié)構(gòu)域；SingnalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析蛋白信號(hào)肽；PredictNLS（http：//www.psort.org/）分析蛋白細(xì)胞核定位信息；通過(guò)MEME（Multiple Expectation for Motif Elicitation）在線軟件（http：// meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）尋找潛在的基序（Motif）；采用ProtParam在線分析軟件分析煙草NtHQT1蛋白序列；用SMART在線分析軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析NtbHLH93蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；使用NCBI Blast在線工具進(jìn)行核酸及氨基酸序列的同源性比對(duì)，并搜索下載相關(guān)序列；用Clustal W軟件對(duì)煙草、擬南芥、水稻、番茄、土豆等植物的bHLH93序列進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA 5.2軟件，通過(guò)鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；用PSIPRED軟件（http：//bioinf.cs. ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測(cè)NtbHLH93蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用在線軟件SWISS-MODEL（http：//swissmodel. expasy.org/）分析NtbHLH93蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 熒光定量PCR分析

根據(jù)克隆到的基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物：上游引物：5′-TGACAAATTCAGCCAAGA-3′，下游引物：5′-CGATAAATCGGGCAGTAA-3′；采用煙草的L25基因作為內(nèi)參基因［15］，上游引物：5′-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3′。定量PCR分析儀器為L(zhǎng)ightCycler?96（Roche，http：//www. roche.com/index.htm），所用試劑均為SYBR Premix Ex TaqTM［寶生物工程（大連）有限公司，http：//www.takara-bio.com/］，qRT-PCR反應(yīng)體系：按照說(shuō)明書的要求在冰上配制20μL反應(yīng)體系，包括SYBR Premix Ex TaqTM，上、下游引物各0.2 μmol/L，每個(gè)反應(yīng)含約50 ng的cDNA，以不加模板作為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)［16］。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)得到的CT值，用2－△△CT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量［17］。經(jīng)L25基因標(biāo)準(zhǔn)化后，以相同處理時(shí)間對(duì)照的相對(duì)表達(dá)量為1，基因的相對(duì)表達(dá)量為該基因與同一時(shí)間對(duì)照處理組的比值。所有數(shù)據(jù)是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05和P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 HQT1基因克隆

以移栽后4周煙草幼苗的cDNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條長(zhǎng)度約為1 300 bp（圖1）的條帶。用PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，以微量菌液為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，含有陽(yáng)性克隆的菌液由北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

2.2 生物信息學(xué)分析

對(duì)獲得的基因序列使用NCBI Blast在線工具進(jìn)行核酸相似性比對(duì)。結(jié)果顯示：該基因與其他植物HQT序列高度相似。與茄科植物馬鈴薯（Solanum tuberosum）和番茄（Solanum lycopersicum）HQT基因的相似度高達(dá)78%；與咖啡（Coffea canephora）和金銀花（Lonicera japonica）HQT基因的相似性分別為71%和67%，與朝鮮薊（Cynara cardunculus var.scolymus）HQT、HQT1和HQT2的相似性分別為66%、68%和66%。推測(cè)克隆的基因?qū)儆贖QT基因家族，命名為NtHQT1。

NtHQT1基因全長(zhǎng)1 305 bp，編碼435個(gè)氨基酸。對(duì)煙草、馬鈴薯、番茄、咖啡、朝鮮薊及金銀花HQT蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖2）顯示：不同植物的HQT編碼蛋白N端差異較大，這可能與N端多為物種特異性信號(hào)肽有關(guān)。通過(guò)MEME在線軟件尋找潛在的基序，與其他植物的HQT基因中得到的8個(gè)保守基序一致，進(jìn)一步說(shuō)明克隆到的基因?qū)儆贖QT基因家族。

煙草NtHQT1蛋白序列預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：該蛋白的分子量是48.58 kDa，等電點(diǎn)為7.22，富含亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸等非極性氨基酸。有46個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基和46個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基。蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為65.7%，預(yù)測(cè)其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)半衰期為30 h，在酵母中的半衰期大于20 h，表明NtHQT1蛋白不穩(wěn)定。平均總親水性系數(shù)（Grand average of hydropathicity）為-0.139，預(yù)測(cè)該蛋白為疏水性蛋白。對(duì)NtHQT1蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：NtHQT1不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，表明不是膜蛋白。該蛋白的核定位信息預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NtHQT1蛋白沒(méi)有細(xì)胞核定位信息，推測(cè)該蛋白沒(méi)有定位在細(xì)胞核內(nèi)。NtHQT1的信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，不具有信號(hào)肽序列（信號(hào)肽序列指跨膜轉(zhuǎn)移的N端的氨基酸序列，一般存在于分泌型的蛋白中），這也說(shuō)明HQT不是分泌型蛋白。在線軟件TargetP 1.0 Server分析表明，此蛋白既不是葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也不是線粒體定位蛋白。結(jié)合跨膜分析和定位分析的結(jié)果，推測(cè)該蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

圖2 煙草NtHQT1蛋白與其他HQT蛋白多重序列比對(duì)

蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：NtHQT1蛋白與煙草HQT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)類似，主要由螺旋、延伸鏈以及無(wú)規(guī)則卷曲組成，其中延伸鏈主要在螺旋和隨機(jī)卷曲之間或者兩個(gè)螺旋之間起連接作用。NtHQT1蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，NtHQT1與羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/ quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT）同源性最高，達(dá)61%。比對(duì)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的煙草HQT［15］與咖啡HCT氨基酸序列相似程度也較高，達(dá)76%，因此以HCT結(jié)構(gòu)為模型構(gòu)建NtHQT1的三級(jí)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4。

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到的不同植物HQT的氨基酸序列，包括煙草、馬鈴薯、番茄、咖啡、金銀花、朝鮮薊等，用Clustal W進(jìn)行相似性比對(duì)，然后用MEGA5軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖5。從進(jìn)化樹(shù)上可以看出NtHQT1與煙草、番茄和馬鈴薯HQT的親緣關(guān)系較為接近。

2.3 不同植物激素對(duì)NtHQT1基因表達(dá)的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)煙草綠原酸的合成及積累有很大影響，萘乙酸（NAA）處理可降低綠原酸含量［18］，馬來(lái)酰肼（MH）處理可使其含量明顯升高［19］。經(jīng)6種植物激素（ABA，GA，MeJA，GR24，IAA和6-BA）分別處理移栽后4周的煙草幼苗的測(cè)定結(jié)果（圖6）顯示，MeJA、IAA、GR24、6-BA和GA能明顯上調(diào)NtHQT1基因的表達(dá)，ABA對(duì)NtHQT1基因表達(dá)沒(méi)有顯著的上調(diào)作用。

圖3 HQT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 HQT蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖5 植物NtbHLH93氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)

圖6 不同激素處理對(duì)NtHQT1基因表達(dá)的影響

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)HQT屬于BAHD乙酰轉(zhuǎn)移酶超家族，該基因家族的酶利用底物?；o酶A催化生成不同的植物代謝產(chǎn)物［20］。HQT催化咖啡酰-CoA和奎尼酸生成綠原酸，敲除HQT基因能夠顯著降低煙草綠原酸的含量［15］。本試驗(yàn)中通過(guò)同源克隆技術(shù)，成功地從普通煙草中克隆到一個(gè)新的HQT基因，命名為NtHQT1，雖然與已經(jīng)克隆的煙草HQT基因序列的相似性只有78%，但分析表明該基因具有HQT基因保守的結(jié)構(gòu)域，是植物HQT基因家族的成員。在朝鮮薊中發(fā)現(xiàn)3個(gè)HQT基因，其相似性在70%左右［21］。根據(jù)NtHQT1和煙草中已經(jīng)克隆到的HQT基因的相似性，推測(cè)煙草中的HQT基因是一個(gè)基因家族。

NtHQT1基因受MeJA、IAA、GR24、6-BA和

GA的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。ABA對(duì)NtHQT1基因表達(dá)沒(méi)有顯著的上調(diào)作用。在山銀花上的研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸在處于分化階段的細(xì)胞中含量最高，在細(xì)胞分化接近成熟時(shí)開(kāi)始急劇減少，而在細(xì)胞趨于衰老時(shí)綠原酸含量最低［21］。IAA、GR24、6-BA和GA 4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素都有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的作用，這與在山銀花中發(fā)現(xiàn)的在分化階段的細(xì)胞中綠原酸含量較高相一致。MeJA處理煙草可使生物堿和酚酸類物質(zhì)含量增加，以增強(qiáng)對(duì)昆蟲(chóng)啃食的抵御［22］，這與本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的MeJA處理煙草可使NtHQT1基因上調(diào)表達(dá)結(jié)果一致。ABA是調(diào)節(jié)干旱脅迫和鹽脅迫的重要激素［23］，ABA沒(méi)有明顯上調(diào)NtHQT1基因的表達(dá)，推測(cè)干旱脅迫等可能不會(huì)上調(diào)綠原酸含量。因此，推測(cè)NtHQT1可能在煙草生長(zhǎng)發(fā)育及抵抗病原菌侵染的過(guò)程中具有重要的作用。

［1］Dogasaki C，Shindo T，F(xiàn)uruhata K，et al.Identification of chemical structure of antibacterial components against Legionella pneumophila in a coffee beverage［J］.Yakugaku Zasshi：Journal of the Pharmaceutical Society of Japan，2002，122（7）：487-494.

［2］Bouayed J，Rammal H，Dicko A，et al.Chlorogenic acid，a polyphenol from Prunus domestica（Mirabelle），with coupled anxiolytic and antioxidant effects［J］.J Neurol Sci，2007，262（1/2）：77-84.

［3］溫紅俠，陳一強(qiáng)，朱蓮娜，等.綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌生物膜干預(yù)作用的體外研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19（12）：1478-1481.

［4］Plumb G W，Garcia-Conesa M T，Kroon P A，et al. Metabolism of chlorogenic acid by human plasma，liver，intestine and gut microflora［J］.J Sci Food Agric，1999，79（3）：390-392.

［5］Nardini M，Cirillo E，Natella F，et al.Absorption of phenolic acids in humans after coffee consumption［J］.J Agric Food Chem，2002，50（20）：5735-5741.

［6］StalmachA，SteilingH，WilliamsonG，etal. Bioavailabilityofchlorogenicacidsfollowingacute ingestion of coffee by humans with an ileostomy［J］. Arch Biochem Biophys，2010，501（1）：98-105.

［7］Rice-Evans C A，Miller N J，Paganga G.Antioxidant properties of phenolic compounds［J］.Trends Plant Sci，1997，2（4）：152-159.

［8］Grace S C，Logan B A，Adams W W.Seasonal differences in foliar content of chlorogenic acid，a phenylpropanoid antioxidant，inMahoniarepens［J］.PlantCell Environment，2002，21（5）：513-521.

［9］Pavlica S，Gebhardt R.Protective effects of ellagic and chlorogenic acids against oxidative stress in PC12 cells［J］.Free Radical Research，2005，39（12）：1377-1390.

［10］周冀衡，朱小平，王彥亭，等.煙草生理與生物化學(xué)［M］.合肥：中國(guó)科技大學(xué)出版社，1996.

［11］Gayed S K，Rosa N.Levels of chlorogenic acid in tobacco cultivars，healthy and infected with Thielaviopsis basicola［J］.Phytopathology，1975，65（10）：1049-1053.

［12］畢詠梅，歐陽(yáng)光察.稻瘟病菌誘導(dǎo)物對(duì)水稻苯丙烷類途徑酶系和綠原酸的誘導(dǎo)作用［J］.植物生理學(xué)通訊，1990，29（3）：18-20.

［13］Camacho-Cristóbal J J，Lunar L，Lafont F，et al.Boron deficiency causes accumulation of chlorogenic acid and caffeoyl polyamine conjugates in tobacco leaves［J］.J Plant Physiol，2004，161（7）：879-881.

［14］Niggeweg R，Michael A J，Martin C.Engineering plants with increased levels of the antioxidant chlorogenic acid［J］.Nat Biotechnol，2004，22：746-754.

［15］Schmidt G W，Delaney S K.Stable internal reference genes for normalization of real-time RT-PCR in tobacco（Nicotiana tabacum）during development and abiotic stress［J］.Mol Genet Genomics，2010，283（3）：233-241.

［16］武明珠，李鋒，王燃，等.煙草轉(zhuǎn)錄因子bHLH93基因的克隆及表達(dá)分析［J］.煙草科技，2015，48（3）：1-7.

［17］Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTMethod［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［18］左天覺(jué).煙草的生產(chǎn)、生理、生物化學(xué)［M］.朱尊權(quán)，等譯.上海：上海遠(yuǎn)東出版社，1993.

［19］耿世磊，寧熙平，吳鴻，等.山銀花不同發(fā)育階段花結(jié)構(gòu)與綠原酸含量變化關(guān)系研究［J］.云南植物研究，2005，27（3）：279-287.

［20］St-Pierre B，De Luca V.Evolution of acyltransferase genes：originanddiversificationoftheBAHD superfamily of acyltransferases involved in secondary metabolism［J］.RecentAdvPhytochem，2000，34：285-315.

［21］SonnanteG，D′AmoreR，BlancoE，etal.Novel hydroxycinnamoyl-coenzyme A quinate transferase genes fromartichokeareinvolvedinthesynthesisof chlorogenic acid［J］.Plant Physiol，2010，153（3）：1224-1238.

［22］Wasternack C，Parthier B.Jasmonate-signalled plant gene expression［J］.Trends Plant Sci，1997，2（8）：302-309.

［23］Zhu J K.Salt and drought stress signal transduction in plants［J］.Annu Rev Plant Biol，2002，53（1）：247-273.

責(zé)任編輯 董志堅(jiān)

Cloning and Expression Analysis of Chlorogenic Acid Biosynthetic GeneNtHQT1 fromNicotiana tabacum

WU Mingzhu,XU Yalong,LI Feng,WEI Pan,WANG Zhong,LUO Zhaopeng,WANG Ran, ZHANG Jianfeng,LIN Fucheng,and YANG Jun*
Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC,Zhengzhou 450001,China

Chlorogenic acid is the dominant polyphenol in leaf tobacco.Hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase（HQT）is the key enzyme in the metabolic pathway of chlorogenic acid in plant.In order to study the function mechanism of HQT gene in the synthesis of chlorogenic acid in tobacco,a new HQT gene was cloned from Nicotiana tabacum by homologous cloning technology and named as NtHQT1.The results of bioinformatics analysis and expression pattern analysis of genes treated by different hormones showed that NtHQT1 cDNA was 1 305 bp in length and encoded 435 amino acids;it was a hydrophobic protein and located in cytoplasm,its secondary structure was mainly of helix and random coil.The expression of NtHQT1 gene was obviously up-regulated by methyl jasmonate（MeJA）, auxin（3-Indoleacetic acid,IAA）,strigolactone（GR24）,cytokinin（6-BA）and gibberellin acid（GA）, while not obviously affected by abscisic acid（ABA）.It suggested that NtHQT1 might play an important role in the course of growth,development and disease resistance of tobacco.

Nicotiana tabacum；Chlorogenic acid；NtHQT1；Cloning；Sequence analysis；Expression analysis

S572.01

A

1002-0861（2015）11-0001-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151101

2015-02-09

2015-07-28

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院院長(zhǎng)科技發(fā)展基金項(xiàng)目“煙草甾醇合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NtbHLH93基因功能研究”（902013CA0330）。

武明珠（1983─），博士，工程師，主要從事煙草基因功能研究。E-mail：mingzhuwus@126.com；*

楊軍，E-mail：yangjun@ztri.com.cn

武明珠，許亞龍，李鋒，等.煙草綠原酸合成關(guān)鍵基因NtHQT1的克隆及表達(dá)分析［J］.煙草科技，2015，48（11）：1-6. WU Mingzhu，XU Yalong，LI Feng，et al.Cloning and expression analysis of chlorogenic acid biosynthetic gene NtHQT1 from Nicotiana tabacum［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：1-6.