周紀(jì)東，李余動(dòng)

(1. 浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，浙江 杭州 310018；2. 浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310035)

微波技術(shù)在黃花菜多糖提取中的應(yīng)用

周紀(jì)東1，李余動(dòng)2

(1. 浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，浙江 杭州 310018；2. 浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310035)

研究應(yīng)用微波技術(shù)以黃花菜為原料提取黃花菜多糖的新工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明，黃花菜多糖最佳提取工藝參數(shù)為微波功率490 W，提取時(shí)間100 s，液固比25 ∶1，提取2次。按此工藝參數(shù)提取，多糖平均得率為31.65%，RSD=2.21%(n=3)；多糖平均含量為18.89%，RSD=2.63%(n=3)；平均回收率為97.92%， RSD=3.13%(n=6)。與水提醇沉法相比，應(yīng)用微波技術(shù)提取黃花菜多糖，每次提取的時(shí)間由3 h減少到100 s，而多糖含量提高了23.63%。

微波技術(shù)；黃花菜；多糖；提取

黃花菜(HemerocalliscitrinaBaroni)屬百合科萱草屬草本植物，又名金針菜、忘憂草，花可食用，味鮮質(zhì)嫩，為我國(guó)特產(chǎn)蔬菜。黃花菜全草可入藥，具有安神醒腦、增智寬胸、美容養(yǎng)血、解熱消毒、除煩通乳之功效，是民間中醫(yī)常用的中草藥[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，黃花菜具有健腦、益智、抗衰老功能，對(duì)神經(jīng)過(guò)度疲勞者、智力衰退的老年人、胎兒發(fā)育甚為有益。黃花菜富含多糖類物質(zhì)[2]。植物多糖來(lái)源廣泛且沒(méi)有細(xì)胞毒性，應(yīng)用于生物體時(shí)毒副作用小，因此相關(guān)研究已成為醫(yī)藥界的熱門領(lǐng)域，在國(guó)內(nèi)外發(fā)展很快[3]。

目前，植物多糖提取多以傳統(tǒng)的水提醇沉法為主，存在成本高、提取率低等問(wèn)題。微波提取技術(shù)是以溶劑浸提法原理為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一種新型萃取技術(shù)，具有快速、節(jié)能、污染小、節(jié)省溶劑、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)提取方法的缺陷[4-5]。近年來(lái)，關(guān)于應(yīng)用微波技術(shù)提取多糖的文獻(xiàn)報(bào)道較多[6-9]，但尚未見(jiàn)使用微波技術(shù)提取黃花菜多糖的相關(guān)報(bào)道。本文將微波技術(shù)應(yīng)用于黃花菜多糖提取，并與傳統(tǒng)的水提醇沉法進(jìn)行對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

黃花菜采自浙江省仙居縣，品種為仙居花，假二歧狀圓錐花序，花蕾呈筒狀，色澤淡黃，外壁縱溝明顯，頂部可分裂為6瓣，內(nèi)有雄蕊6枚，雌蕊1枚。

試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，木瓜蛋白酶為E.Merck公司產(chǎn)品。

主要設(shè)備有：752W型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海朗伯儀器有限公司)，Anke TDL-40B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，DZF-6021型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，NJC03-2x型微波提取設(shè)備(南京杰金微波設(shè)備有限公司)。

1.2方法

1.2.1 多糖提取與精制

1.2.1.1 微波提取粗多糖

取黃花菜樣品，干燥，制成粉末，用石油醚60～90 ℃回流脫脂3 h，再用80%乙醇85 ℃回流6 h，以除去單糖、寡糖等，自然風(fēng)干濾渣。稱取10 g濾渣，加入一定量蒸餾水，置于微波提取器中，調(diào)整微波功率、微波提取時(shí)間和液固比進(jìn)行提取，提取液用紗布過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至約100 mL，加入4倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行醇析沉淀，4 ℃靜置過(guò)夜，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，即可獲得粗多糖。

1.2.1.2 傳統(tǒng)工藝提取粗多糖

用同樣的方法制得黃花菜濾渣。稱取10 g濾渣，以液固比20 ∶1，80 ℃熱水浸提3 h，提取2次，分別用紗布過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至約100 mL，加入4倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行醇析沉淀，4 ℃靜置過(guò)夜，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，即可獲得粗多糖。

1.2.1.3 精制多糖制備

將粗多糖復(fù)溶于水，采用中性酶(木瓜蛋白酶)-Sevag法[10]除去蛋白質(zhì)，并用H2O2氧化法[11]脫色，然后，透析36 h，減壓濃縮后再次醇析沉淀多糖，4 000 r/min離心10 min，所得沉淀分別用95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮洗3次，60 ℃真空干燥，即得精制多糖。

1.2.2 微波提取工藝參數(shù)的單因素實(shí)驗(yàn)

影響多糖得率的因素較多，選擇微波功率、提取時(shí)間、液固比、提取次數(shù)作為考察因素，在保持其他因素相同的條件下，分別考察上述各因素對(duì)多糖得率的影響。

1.2.3 微波提取工藝參數(shù)的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定正交實(shí)驗(yàn)的因素水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以多糖得率為主要考察指標(biāo)，研究微波提取工藝參數(shù)的最佳組合。

為驗(yàn)證最佳工藝參數(shù)，準(zhǔn)確稱取3份各10 g黃花菜樣品，分別脫脂除糖后按照優(yōu)化所得最佳組合參數(shù)進(jìn)行微波提取，然后，減壓濃縮和醇析沉淀，計(jì)算多糖得率。

1.2.4 多糖含量測(cè)定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用文獻(xiàn)所述的苯酚-硫酸法[12]，以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，所得回歸方程為

(1)

其中r2=0.999 6，n=6。

該標(biāo)準(zhǔn)曲線在葡萄糖濃度為5.00～80.00 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.4.2 換算因素的計(jì)算

準(zhǔn)確稱取3份各20 mg黃花菜精制多糖，用蒸餾水溶解，定容至100 mL。準(zhǔn)確吸取0.3 mL，按照1.2.4.1中所述方法測(cè)定吸光度，由回歸方程(1)計(jì)算供試液中葡萄糖濃度，根據(jù)公式

(2)

計(jì)算換算因素。式(2)中，F(xiàn)為換算因素，W為多糖質(zhì)量(μg)，C為多糖供試液中葡萄糖濃度(μg/mL)，D為多糖的稀釋因素。經(jīng)計(jì)算得黃花菜多糖相對(duì)于葡萄糖的換算因素

F=1.518(RSD=1.13%，n=3)。

1.2.4.3 樣品中多糖含量測(cè)定及對(duì)比實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取6份各10 g黃花菜樣品，按照1.2.1中的微波提取工藝(優(yōu)化后)和傳統(tǒng)提取工藝分別制備精制多糖各3份，分別用蒸餾水溶解，定容到500 mL，稀釋100倍后準(zhǔn)確吸取1 mL，按照1.2.4.1中所述方法測(cè)定吸光度，由回歸方程(1)計(jì)算供試液中葡萄糖濃度，根據(jù)公式

(3)

計(jì)算黃花菜樣品中多糖含量，并作對(duì)比。式(3)中，X為多糖含量。

1.2.5 回收率測(cè)定

準(zhǔn)確稱取6份各10 g黃花菜樣品，分別加入0.5 g自制的黃花菜精制多糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，按照優(yōu)化后的微波提取工藝制備6份精制多糖，按照1.2.4.3中的方法測(cè)定加標(biāo)(準(zhǔn)確稱取6份各10 g黃花菜樣品，分別加入黃花菜精制多糖0.5 g)樣品中多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波功率

采用液固比25 ∶1，調(diào)整微波功率P，微波提取30 s，研究微波功率對(duì)多糖得率的影響。結(jié)果詳見(jiàn)圖1。

圖1 微波功率對(duì)多糖得率的影響

如圖1所示，微波功率P≤560 W時(shí)，隨著提取所用的微波功率的增大，多糖得率不斷增加，當(dāng)P=560 W時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)微波功率P>560時(shí)，隨著微波功率的增大，多糖的得率有所下降。由此可以推測(cè)，微波功率對(duì)黃花菜細(xì)胞的破壁過(guò)程有一定的影響，560 W是黃花菜多糖微波提取的合適功率。

2.1.2 提取時(shí)間

采用微波功率560 W，液固比25 ∶1，調(diào)整提取時(shí)間T，研究提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

圖2 微波提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

如圖2所示，在前90 s，隨著微波提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率有所增加，90 s后逐步回落并趨于平緩。為了縮短工時(shí)，減少能耗，微波提取時(shí)間選擇90 s為宜。

2.1.3 液固比

采用微波功率560 W，提取90 s，調(diào)整液固比R，研究液固比對(duì)多糖得率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 液固比對(duì)多糖得率的影響

如圖3所示，液固比對(duì)多糖得率的影響呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)，即先隨著液固比的增加，多糖得率逐漸增加，當(dāng)液固比達(dá)到30 ∶1后，多糖得率不再增加并趨于穩(wěn)定。結(jié)合后續(xù)的濃縮工藝，選擇液固比30 ∶1為宜。

2.1.4 提取次數(shù)

采用微波功率560 W，液固比為30 ∶1，提取90 s，調(diào)整提取次數(shù)N，研究提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖4。

如圖4所示，微波提取3次得到的多糖最多，而后，隨著次數(shù)的增加，每次提取到的多糖得率增幅越來(lái)越小，并趨于恒定。從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，浸提次數(shù)應(yīng)不少于3次。

圖4 微波提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響

2.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定因素水平，詳見(jiàn)表1。正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)L9(34)方案及結(jié)果

由表2可知，根據(jù)極差分析結(jié)果，4個(gè)因素對(duì)多糖得率影響的主次順序是：提取時(shí)間(T)>微波功率(P)>提取次數(shù)(N)>液固比(R)，最佳組合為P1T3R1N1，即微波提取工藝參數(shù)為微波功率490 W，提取時(shí)間100 s，液固比25 ∶1，提取2次。按照此最佳組合參數(shù)進(jìn)行微波提取工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，多糖平均得率為31.65%(RSD=2.21%，n=3)。

2.3樣品中多糖含量測(cè)定及對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

不同提取方法所得多糖含量見(jiàn)表3。

表3 對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，與水提醇沉法相比，工藝參數(shù)優(yōu)化后，應(yīng)用微波技術(shù)提取黃花菜多糖，每次提取時(shí)間由3 h驟減為100 s，而多糖含量提高了23.63%。結(jié)合微波提取法的其他優(yōu)點(diǎn)，表明該方法是黃花菜多糖較為理想的提取方法。

2.4回收率測(cè)定結(jié)果

1.2.5中所得黃花菜精制多糖的供試液分別測(cè)量吸光度，代入公式(3)計(jì)算多糖含量，其平均回收率為97.92%(RSD=3.13%，n=6)。

3 結(jié)論

1) 黃花菜多糖的微波提取工藝參數(shù)為微波功率490 W，提取時(shí)間100 s，液固比25 ∶1，提取2次。按此參數(shù)提取，多糖得率為31.65%,多糖含量為18.89%，回收率為97.92%。

2) 將微波技術(shù)應(yīng)用于黃花菜多糖提取，效率高，成本低，效果明顯優(yōu)于常規(guī)的水提醇沉法，故值得應(yīng)用于擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)。

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〔責(zé)任編輯： 盧 蕊〕

Applicationofmicrowavetechniquesintheextractionofpolysaccharidesfromdaylily

ZHOU Ji-dong1, LI Yu-dong2

(1. Biotechnology Department, Zhejiang Yuying Vocational Technology College，Hangzhou 310018, China；2.College of Food and Bioengineering, Zhejiang University, Hangzhou 310035, China)

A new method of microwave technique was used to extract the polysaccharides from Daylily. Based on the results of single factor tests, the optimum parameters of polysaccharides extraction were studied by orthogonal tests. The results showed that the optimal microwave power, the time for extraction the ratio of liquid to solid and times of extraction，were 490W, 100s, 25 ∶1 and 2 times, respectively. With the techniques， the average rate of polysaccharides extraction was 31.65%, RSD=2.21%(n=3), the average content of polysaccharides 18.89%, RSD=2.63%(n=3), and the average recovery rate 97.92%, RSD=3.13%(n=6). Compared with water extraction and alcohol precipitation, the time for extraction with microwave was reduced from 3 hours to 100 s and the content of polysaccharides was increased 23.63%.

microwave technique; daylily; polysaccharides; extraction

2014-07-26

周紀(jì)東(1976—)，男，浙江杭州人，講師，碩士，主要從事生物大分子制備與應(yīng)用研究；李余動(dòng)(1977—)，男，浙江溫州人，副教授，博士，主要從事微生物遺傳學(xué)研究。

R284.2

： A

：1008-8148(2015)01-0066-04