李雪巖，師 帥，李德韜，包 瑞△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2.大慶油田總醫(yī)院腦血管醫(yī)院，黑龍江大慶163000)

中風(fēng)病作為常見病，其發(fā)病年齡日趨年輕化，筆者在探尋更好的治療方案中發(fā)現(xiàn)，頭穴透刺治療疾病，可以減少針刺的數(shù)量，而達到最佳的治療效果。本實驗進行頭穴透刺與腦含水量及水通道蛋白4(AQP-4)的關(guān)系研究，希望對醫(yī)療實踐有所幫助。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性Wistar 大鼠，重(250 ～300)g。

1.2 實驗試劑

①AQP-4 試劑盒，武漢博士德生物有限公司;②多聚賴氨酸，廣州市一科生物有限公司;③伊文思蘭，上海遠慕生物技術(shù)有限公司;④多聚甲醛，南京中科聯(lián)實業(yè)有限公司;⑤磷酸氫二鈉，上海劍誠化工有限公司;⑥氯化鈉，分析純，廣州市一科生物有限公司;⑦磷酸二氫鈉，鄭州超凡化工食品有限公司。

1.3 實驗設(shè)備

①KD-BM 生物組織包埋機，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司;②HD-300 自動脫水機，湖北慧達儀器公司;③微量注射器，上海高鴿工貿(mào)有限公司;④307-B 臺式，牙鉆機，安徽中科都菱股份有限公司;⑤電子天平，松山儀器設(shè)備有限公司;⑥RM2235 石蠟切片機，北京瑞萊寶泰科技發(fā)展有;⑦TEC-2500 型展片機，常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司;⑧TKY-TKA烤片機，湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司;⑨恒溫低溫冰箱，陜西海聯(lián)化玻儀器化工有限公司;○10電熱恒溫箱，上海善志儀器設(shè)備有限公司;○1 數(shù)碼相機，韓國;○12ZH-藍星B 型立體定位儀，中國安徽儀器廠;○13JD801病理圖像分析系統(tǒng)，江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司;○14圖像分析軟件，Motic 公司生產(chǎn);○15TDZ5-WS多管架自動平衡離心機，湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司;○16JEM-2010 透射電子顯微鏡，日本電子株式會社。

1.4 動物分組及處理

將96 只健康雄性大鼠隨機分為3 組:對照組32只、模型組32 只、針刺組32 只，每組分4 個時間點，每個時間點8 只大鼠。于造模成功6 h 后，給予相應(yīng)的針刺治療，然后在對應(yīng)的4 個時間點(12 h、24 h、3 天、7 天)停止治療，取材;每個時間點4 只測定腦含水量，另外4 只檢測AQP-4 表達。

對照組:將2 ul 0.9%的生理鹽水注入腦內(nèi)尾狀核中心部。

模型組:造模后12 h、24 h、3 天、7 天分別取材。

針刺組:造模成功6 h 后，給予針刺治療，針刺腦出血側(cè)百會穴透懸厘穴1 次/天;留針30 min，10 min捻轉(zhuǎn)1 次，每次1 min，以200 轉(zhuǎn)/min 速度捻針;針刺治療后于12 h、24 h、3 天、7 天分別取材。取穴方法參照華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》。

1.5 造模

根據(jù)圖譜確定鼠尾狀核。定向注射膠原酶誘發(fā)大鼠ICH 模型。麻醉，消毒，定點、定位后，用自動推進器按每只0.8 U(0·1 U/μL)膠原酶Ⅶ，以1 μL/min 的速度注入一側(cè)尾狀核，出針?？p合，局部消毒。

1.6 標本制備

麻醉，暴露心臟，插管，于右心耳做出口。灌注，流出液變清，灌注，標本變硬。取腦，切片，固定，脫水、浸蠟、包埋制成石蠟切片用于AQP-4 免疫組化檢測。

1.7 測定含水量

腦含水量:BWC=(WW-DW)/WW×100%。

腦組織至鋁箔表面，吸干腦脊液，稱其總重。濕重(WW)= 總重- 己稱重的鋁箔重量;然后包好放入100℃的恒溫干燥箱內(nèi)烘干24 h，取出恢復(fù)到室溫后，得總重2。干重(DW)=總重2-己稱重的鋁箔重量。

1.8 檢測AQP-4

石蠟切片，脫蠟→孵育→蒸餾水沖洗、修復(fù)液修復(fù)，冷卻，PBS 沖洗→滴加一抗，4℃冰箱過夜→PBS 液沖洗→滴加生物素標記→PBS 液沖洗→滴加辣根酶標記→PBS 液沖洗→DAB 顯色→流水沖洗、蘇木素復(fù)染脫水、透明→中性樹膠封片。

1.9 AQP-4 免疫組化圖像分析

每只大鼠共染色5 張切片，每張切片選取4 個區(qū)域進行觀察并分析陽性區(qū)面積百分比。

1.10 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織含水量比較

針刺組各時間點控制腦含水量優(yōu)于對照組與模型組(P ＜0.05);對照組各點腦含水量低于模型組(P ＜0.05)，說明針刺組有效的控制了腦水腫，促進腦出血恢復(fù)。如表1。

2.2 各組大鼠腦組織AQP-4 表達比較

針刺組各時間點控制AQP-4 的表達效果優(yōu)于對照組與模型組(P ＜0.05);對照組的各點AQP-4 的表達低于模型組(P ＜0. 05)，說明針刺組抑制了AQP-4 的表達，減輕了腦水腫，修復(fù)了神經(jīng)元細胞。如表2。

表1 針刺對腦出血大鼠腦組織含水量的影響(±s)

表1 針刺對腦出血大鼠腦組織含水量的影響(±s)

組別 n 12 h 24 h 3 天 7天對照組 4 75.81±0.59 76.39±0.56 77.01±0.49 75.14±0.41模型組 4 77.96±0.38 79.76±0.49 84.01±0.40 80.12±0.41針刺組 4 76.61±0.31 77.27±0.41 78.13±0.39 76.12±0.42

表2 各組大鼠腦組織AQP-4 表達的比較(±s)

表2 各組大鼠腦組織AQP-4 表達的比較(±s)

組別 n 12 h 24 h 3 天 7天對照組 4 43.71±2.68 48.28±4.18 57.21±3.45 35.43±2.37模型組 4 44.11±6.63 52.15±3.18 64.00±3.31 44.25±3.65針刺組 4 35.51±3.21 44.12±4.37 49.15±2.24 29.24±2.52

3 討論

本實驗建立在多年臨床治療實踐過程中取得的療效基礎(chǔ)上，很多學(xué)者［1-2］通過實驗證明頭針對腦出血內(nèi)的神經(jīng)因子有促進作用。腦出血發(fā)生時血管壁為了減輕自身的壓力，會向堤壩一樣，裂開一個小口，釋放一部分血液到脈外，使脈內(nèi)的壓力減輕。但是腦實質(zhì)不能接納被釋放出來的血液，腦實質(zhì)受到擠壓，導(dǎo)致部分腦細胞萎縮、壞死，進而出現(xiàn)腦水腫。所以腦出血后如何減輕腦水腫的程度，減少腦細胞的萎縮、壞死是醫(yī)者急需要解決的關(guān)鍵問題。針刺百會透懸厘可以促進釋放出來的血液的吸收，繼而減輕后續(xù)對腦組織的損傷。春、秋季節(jié)變化時，在東北地區(qū)室內(nèi)室外的溫差較大，很多人適應(yīng)不了驟然變化的溫度，特別是此時的血管伸張、收縮受到動脈硬化及血管脆化的影響易導(dǎo)致部分血管破裂，所以春、秋是腦出血的高發(fā)期，及早的預(yù)防也是必要的。而出血后第一時間的控制腦水腫，控制顱內(nèi)壓，防止二次出血也是關(guān)鍵。張國威等［3］應(yīng)用頭穴對腦出血治療可以通過抑制內(nèi)源性AQP-4 表達進而減輕腦水腫。

其實腦出血的誘發(fā)因素還有很多，在頭穴透刺治療的同時也需要考慮。比如飲食習(xí)慣、吸煙史、糖尿病史、高血壓病史等?？刂葡嚓P(guān)并發(fā)疾病對治療非常重要。針刺本實驗指定的穴位，其下是腦運動區(qū)(即中央前回)和腦感覺區(qū)(即中央前回)，而運用透刺可以擴大治療范圍、減少針刺的數(shù)量而達到最大的治療效果，減少因多針帶給患者的拒絕接受針刺治療。李妍、楊奎等［4-5］通過藥物治療腦出血大鼠后也證實控制AQP-4 的表達可以抑制腦水腫形成。本實驗中針刺治療后檢測AQP-4 的表達可以看到:針刺組對其都有抑制作用，進而控制腦水腫的程度。從本實驗數(shù)據(jù)看針刺后控制了大鼠的腦水腫程度，同時參考李妍等學(xué)者的實驗結(jié)論，考慮未來可以進行針刺聯(lián)合藥物治療的實驗設(shè)計方案，期待會有更好的效果。

查閱資料發(fā)現(xiàn)針灸十二經(jīng)筋的走行特點一部分命名為維筋相交，手陽明經(jīng)筋循行也是交叉的，說明先人早已理解腦部管理肢體運動是交叉性的，而治療也是根據(jù)這一理論。筆者經(jīng)過長期的臨床觀察又通過現(xiàn)在的實驗研究可以充分證實本針刺方法是有效的，也是值得推廣應(yīng)用的。本實驗的治法優(yōu)點在于:首先，針刺數(shù)量少，減少了因多針針刺使個別患者因恐懼而拒絕治療;其次，擴大治療范圍，透刺后貫穿了管理對側(cè)肢體的運動和感覺功能區(qū)，以此達到最大的治療效果;再次，通過針刺對經(jīng)絡(luò)的調(diào)控機制，促進了瘀血的吸收同時減輕腦組織的水腫和細胞的凋亡。

本實驗通過針刺百會透懸厘治療腦出血大鼠證明:頭穴透刺減輕腦水腫并修復(fù)腦細胞，降低腦含水量而促進腦出血恢復(fù);頭穴透刺對腦內(nèi)AQP-4 的表達有抑制作用，進而控制腦水腫而保護腦受損的神經(jīng)元。

［1］ 鄒偉，劉芳，孫曉偉，等.頭針對急性腦出血大鼠BDNF 和NGF 表達的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2010，13(6):13

［2］ 石秋艷，何俊芳，孫惠芳，等.腦出血大鼠腦內(nèi)NGF 和BDNF 蛋白表達變化的研究［J］.中國醫(yī)藥指南，2010，8(7):7

［3］ 張國威，鄒偉，劉芳，等.“百會”透“曲鬢”對急性腦出血大鼠腦組織AQP-4 表達影響的實驗研究［J］. 中醫(yī)藥信息，2010，6(3):34-35

［4］ 李妍，崔向?qū)?，陳澤濤，? 活血化瘀中藥對腦出血大鼠腦組織含水量及AQP4 表達的影響［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，3(19):23-24

［5］ 楊奎，戴揚，鄔春久，等. 梔子總環(huán)烯醚萜苷對大鼠腦出血AQP4和MMP-2/9 表達的影響［J］.中藥藥理與臨床，2010，9(2):22