齊丹丹，張 梅，郭孟瑋，2，劉珍珍，章慶慶，任曉暄，2，趙雅芳，2，李曉泓，3，

嵇 波1，2，3，張露芬1，2，朱 江1，3 △

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029;2.國家中醫(yī)藥管理局針灸生物學(xué)三級實驗室，北京100029;3.國家中醫(yī)藥管理局針灸特色療法評價重點研究室，北京100029)

原發(fā)性痛經(jīng)是指生殖器官沒有器質(zhì)性病變，在行經(jīng)前后或在行經(jīng)期出現(xiàn)腹痛、腰酸、下腹墜脹或其它不適，影響生活和工作，是青春期女性最常見的婦科病之一，在對女大學(xué)生原發(fā)性痛經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病率在70%以上［1-3］。阿片類物質(zhì)是公認(rèn)內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)，針刺可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放某種具有鎮(zhèn)痛作用的阿片肽類物質(zhì)發(fā)揮不同鎮(zhèn)痛作用［4］，在不同電針頻率下［5］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)阿片類物質(zhì)mRNA 的表達(dá)情況不同。在前期研究中，觀察到不同針刺刺激量誘導(dǎo)不同“得氣”狀態(tài)對寒凝證類痛經(jīng)大鼠調(diào)節(jié)起到不同調(diào)節(jié)作用，其中強刺激誘導(dǎo)動物“得氣”狀態(tài)可在緩解扭體程度、上調(diào)子宮組織內(nèi)μ 受體mRNA 起到更好效果［6］，為觀察不同“得氣”狀態(tài)下中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)阿片物質(zhì)含量變化，采用粗針深刺行手法與細(xì)針淺刺不行手法不同刺激量，觀察誘導(dǎo)不同“得氣”狀態(tài)對大鼠中腦、脊髓阿片類受體mRNA 的表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明“得氣”的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及生理機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

采用清潔級Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，鼠齡3 個月，體重(230 ±20)g，性成熟未交配，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院提供，合格證號:SCXK2004-007(京)。飼養(yǎng)條件:國家中醫(yī)藥管理局針灸生物學(xué)三級實驗室動物房內(nèi)，室內(nèi)溫度(23 ±1)℃，濕度(45 ±5)%，日光燈光照，普通清潔級鼠飼料，自由飲用自來水。

1.2 實驗試劑、儀器及耗材

苯甲酸雌二醇注射液:寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號120207;縮宮素注射液:上海禾豐制藥廠生產(chǎn)，批號120302;自制美蘭染色溶液;20%烏拉特注射液:批號T20080530;Trizol:Invitrogen 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ImProm-IITMReverse Transcription System:Promega 公司;DEPC 水:Amresco 公司;石蠟油250ml:Sigma 公司;瓊脂糖:西班牙;氯仿:AR(滬試);異丙醇:AR(滬試);dNTPs Mix(10 mM each):北京索來寶科技有限公司;Taq DNA Polymerase:北京索來寶科技有限公司;Marker I DNA Ladder:北京索來寶科技有限公司;引物:生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計;1.5 ml EP 管，0.6 mlEP 管，BC/BD-379HB 臥式冰柜:青島海爾集團(tuán)。

2 實驗方法

2.1 動物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將處于動情間期的44 只雌性SD 大鼠，按照隨機數(shù)字法分為鹽水對照組8 只，寒凝證類痛經(jīng)模型組(模型組)、刺激量A 組(期望“得氣”組)與刺激量B 組(期望“不得氣”組)每組12 只。

2.2 寒凝證類痛經(jīng)模型的建立

采用動情間期SD 大鼠全身冷凍法配合苯甲酸雌二醇注射法造模。除鹽水組外，其余各組大鼠采用全身冷凍法制備寒凝證模型，即第1 天至第5 天將大鼠(每8 只一籠)放入-25℃冰柜冷凍4 h，2 h 后打開冰柜換氣5 s，同時給予苯甲酸雌二醇注射，第1 天及第10 天日注射0.5 mg/只，余日均0.2 mg/只，鹽水組每日給予同等劑量的生理鹽水。模型組及針刺組于末次給藥1 h 后，腹腔注射縮宮素2 U/只，鹽水組在皮下給予生理鹽水1 h 后，腹腔注射生理鹽水2 U/只。

2.3 針刺取穴穴位

選用大鼠仰臥位，根據(jù)大鼠形態(tài)、解剖、生理特點，參照林文注主編《實驗針灸學(xué)》［7］穴位標(biāo)準(zhǔn)定位，“三陰交”穴位于后肢內(nèi)踝尖上10 mm。

2.4 針刺干預(yù)方法

刺激量A 組采用相對粗針Φ0.25 ×40 mm，深刺入大鼠三陰交穴4 ～5 mm，且刺入即刻和留針10 min時分別施平補平瀉手法30 s;刺激量B 組，采用相對細(xì)針Φ0.18 ×13 mm，淺刺入大鼠三陰交穴1 ～2 mm，不施手法。兩組均留針20 min。

2.5 樣本采集

針刺后20 min，大鼠去冠處死，迅速分離取出子脊髓和中腦，取中腦四疊體及脊髓T12 ～L5 節(jié)段加入1.5 mlEP 管內(nèi)，加入0.5 ml Trizol 于冰上研磨，待研磨后再加入0.5 ml Trizol，統(tǒng)一放于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

2.6 RT-PCR 法檢測子宮組織內(nèi)相關(guān)物質(zhì)mRNA 的表達(dá)

2.6.1 提取RNA ①EP 管于室溫內(nèi)解凍1 h 后，于自動振蕩器上震蕩1 min 后常溫放置10 min;加入200 ml氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩15 s，室溫孵育2 ～3 min，使用離心機于12000 rpm，離心15 min。②離心后EP 管內(nèi)水與沉淀物分離，氯仿將RNA 溶解于上層水樣層中，使用1 ml移液器將水溶液轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入500 ml 異丙醇，顛倒混勻后，常溫靜置10 min。③使用異丙醇沉淀RNA 后于離心機內(nèi)采用12000 rpm 離心10 min。④離心后EP 管內(nèi)下放出現(xiàn)點狀白色或者透明狀沉淀物，使用1 ml 和200 ml 移液器，兩次小心吸走液體，留沉淀在管底。⑤加入1 ml 75%的乙醇清洗沉淀RNA 組織上的異丙醇?xì)埩?，上下顛倒離心管數(shù)下，將沉淀物搖晃置乙醇溶劑中采用7500 rpm 離心，5 min。⑥離心后用槍小心吸走液體，留沉淀在管底。干燥沉淀10 min，加入DEPC 水20 ul溶解沉淀10 min。⑦使用酶標(biāo)儀檢測OD260/280 檢測RNA 純度，后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

2.6.2 逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)Promega ImProm-IITMReverse Transcription System 試劑盒加入隨機引物及模板引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在PCR 儀上設(shè)置25℃反應(yīng)5 min;42℃反應(yīng)1 h;70℃15 min 終止反應(yīng)取出。

2.6.3 擴增 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中μ 受體、κ 受體及βactin 基因序列，以Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，由北京生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min 進(jìn)入循環(huán):94℃30 s 變性，退火溫度×30 s 退火，72℃60 s 延伸，共40 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。見表1。

表1 μ 受體、κ 受體及βactin 基因序列設(shè)計

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以ˉx ± s 表示。應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組組間差異采用單因素方差分析，繼以LSD 檢驗，等級資料用非參數(shù)檢驗，以P ＜0.05 作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同針刺刺激量對寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠中腦κ、μ 受體mRNA 表達(dá)的影響

見表2。中腦κ 受體mRNA 表達(dá):與鹽水組比較模型組表達(dá)顯著減弱，與模型組比較刺激量A 組表達(dá)顯著增強，與刺激量A 組比較刺激量B 組表達(dá)顯著減弱(P ＜0.05)。

表2 不同針刺刺激量對寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠中腦κ、μ受體mRNA 表達(dá)的影響(±s)

表2 不同針刺刺激量對寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠中腦κ、μ受體mRNA 表達(dá)的影響(±s)

注:與鹽水組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01;與刺激量A 組比較，●P ＜0.05。

組別 例數(shù) 中腦κ 受體mRNA 表達(dá) 中腦μ 受體mRNA 表達(dá)鹽水組8 1.41 ±0.68 1.69 ±0.86模型組 12 1.21 ±0.37Δ 1.75 ±0.95刺激量A 組 12 1.71 ±0.60☆ 2.45 ±0.92Δ☆☆刺激量B 組 12 1.44 ±0.59●2.12 ±0.84

中腦內(nèi)μ 受體mRNA 表達(dá):與鹽水組、模型組比較，刺激量A 組表達(dá)顯著增強(P ＜0.05 或0.01)。

3.2 不同針刺刺激量對寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠脊髓κ、μ 受體mRNA 表達(dá)的影響

脊髓內(nèi)κ、μ 受體mRNA 表達(dá):與鹽水組比較，刺激量A 組、刺激量B 組κ、μ 受體表達(dá)均顯著增強，P ＜0.05;與模型組比較，刺激量A 組κ、μ 受體mRNA表達(dá)均顯著增多，P ＜0.05。見表3。

表3 不同針刺刺激量對寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠脊髓κ、μ 受體mRNA 表達(dá)的影響(±s)

表3 不同針刺刺激量對寒凝證類痛經(jīng)模型大鼠脊髓κ、μ 受體mRNA 表達(dá)的影響(±s)

注:與鹽水組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，☆P ＜0.05。

組別 例數(shù) 脊髓κ 受體mRNA 表達(dá) 脊髓μ 受體mRNA 表達(dá)鹽水組8 0.43 ±0.12 0.41 ±0.13模型組 12 0.51 ±0.16 0.46 ±0.21刺激量A 組 12 0.69 ±0.29Δ☆ 0.63 ±0.29Δ☆刺激量B 組 12 0.68 ±0.25Δ 0.61 ±0.24 Δ

4 討論

阿片以及合成的阿片類活性堿等藥物已廣泛用于止痛治療，現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)阿片類物質(zhì)通過激活阿片受體系統(tǒng)而產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛作用。現(xiàn)已證實分布于中腦、下丘腦、延髓及脊髓背角的阿片受體存在廣泛鎮(zhèn)痛作用［8-9］。在疼痛相關(guān)的機制探討中，一直認(rèn)為以嗎啡為代表的μ 受體為鎮(zhèn)痛作用的關(guān)鍵，同時解剖學(xué)內(nèi)分析痛覺的產(chǎn)生、傳導(dǎo)及調(diào)節(jié)與脊髓內(nèi)κ 受體及內(nèi)源性阿片肽密切相關(guān)［10］，κ 阿片受體被內(nèi)源性阿片肽激活可改變痛覺傳入纖維對疼痛刺激信號的反應(yīng)性，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

在針灸臨床報道及現(xiàn)代化研究中，不同電針頻率干預(yù)后可觀察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)阿片肽調(diào)節(jié)作用不同［11］，針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)常與內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)密切相關(guān)。不同的刺激量與療效及得氣關(guān)系密切，針刺治療中對刺激量影響因素較多，如針刺角度深淺、電針頻率、針具的規(guī)格、留針時間密切相關(guān)，因此采用粗針深刺行手法及細(xì)針淺刺不行手法作為誘導(dǎo)動物不同“得氣”狀態(tài)的干預(yù)方式觀察中腦及脊髓內(nèi)阿片受體的mRNA 表達(dá)情況。

研究結(jié)果顯示，模型組中腦內(nèi)κ 受體表達(dá)顯著下降，中腦內(nèi)μ 受體和脊髓內(nèi)阿片受體mRNA 的表達(dá)均呈現(xiàn)升高趨勢，提示痛經(jīng)發(fā)生時中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)阿片受體表達(dá)呈現(xiàn)一定升高趨勢，不同針刺刺激量干預(yù)后，中腦內(nèi)結(jié)果顯示粗針深刺行手法干預(yù)的刺激量A 組可以明顯增強κ、μ 受體mRNA 的表達(dá)。綜上所述，粗針深刺行手法的強刺激可以對中腦及脊髓組織內(nèi)κ受體、μ 受體的mRNA 表達(dá)起到上調(diào)作用，是針刺“得氣”改善痛經(jīng)疼痛程度發(fā)揮鎮(zhèn)痛的作用機制之一。

［1］ 孫艷明，王玲，李戈.1800 名女大學(xué)生痛經(jīng)影響因素調(diào)查分析［J］.天津中醫(yī)藥，2009(5):367-369

［2］ 張麗凡，鄭麗英.女大學(xué)生原發(fā)性痛經(jīng)現(xiàn)狀及影響因素分析［J］.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013(6):71-74

［3］ 任寶紅.青春期女性原發(fā)性痛經(jīng)與心理暗示的相關(guān)性研究［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012(29):9-11

［4］ Han JS. Acupuncture:neuropeptide release produced by electrical stimulation of different frequencies［J］. Trends Neurosci，2003，6(1):17-22

［5］ 王韻，王曉民，韓濟(jì)生.不同頻率電針耐受對κ 阿片受體mRNA 轉(zhuǎn)錄的影響［J］.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1998(1):1-4

［6］ 張玲，郭盂瑋，申松希，等. 不同針刺刺激量對寒凝證類痛經(jīng)大鼠疼痛及子宮μ 受體的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2014(2):8-12

［7］ 林文注，王佩. 實驗針灸學(xué)［M］. 上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，

1999:288

［8］ Sandner-Kiesling A，Lisenaeh JC.Pharmacology of opioid in hibition to noxious uterine cervical distension［J］. Anesthesiology，2002，97(4):966-971

［9］ Larsson MH，Bayati A，Lindstrom E，et al.lnvolvement of kappa opioid receptors in visceral nociception in mice［J］.NeurogastroenterolMoti1，2008，20(10):1157-1164

［10］ Yeomans DC，Jones T，Laurito CE，et al. Reversal of ongoing thermal hypertalgesis in mice by a recombinant herpesvirus that encodes human preproenkephalin［J］.Mol Ther，2004，9(1):24-29

［11］ 張國璽，葛子.電針深刺淺刺環(huán)跳穴對人自鼠鎮(zhèn)痛及藍(lán)斑內(nèi)組化成分的影響田［J］.針刺研究，1990(3):203-205