韓萬偉,唐翔,劉連仲,葉春伶,王曉梅,閆建亮

(北京市回民醫(yī)院 骨傷科，北京 100054)

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成骨生長肽對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制

韓萬偉,唐翔,劉連仲,葉春伶,王曉梅,閆建亮

(北京市回民醫(yī)院 骨傷科，北京 100054)

目的 探討成骨生長肽(osteogenic growth peptide，OGP)對MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖的影響及其機(jī)制。方法 常規(guī)培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1，分為OGP高、中、低劑量組(1×10-8、1×10-10、1×10-12mol/L)以及對照組，利用MTT法檢測OGP作用24 h、48 h以及72 h對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖作用，利用免疫化學(xué)染色法檢測成骨細(xì)胞I型膠原蛋白水平，ELISA法檢測骨橋蛋白(osteopontin，OPN)含量。結(jié)果 在24 h時，各劑量OGP對MC3T3-E1的增殖無影響；作用48、72 h，OGP 10-10mol/L以及 OGP 1×10-8mol/L顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖(P<0.05)，其中OGP 1×10-8mol/L 48 h促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)。作用24 h，各組成骨細(xì)胞I型膠原蛋白IOD值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；作用48 h，OGP 1×10-8mol/L組細(xì)胞I型膠原蛋白IOD值顯著高于對照組(P<0.05)；作用72 h，OGP 1×10-10mol/L組以及OGP 1×10-8mol/L組細(xì)胞I型膠原蛋白IOD值均顯著高于對照組(P<0.05)。作用24 h，各組成骨細(xì)胞OPN OD值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；作用48 h、72 h，OGP 1×10-10mol/L組以及OGP1×10-8mol/L組細(xì)胞OPN OD值顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 OGP能夠明顯促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖，其可能的作用機(jī)制是增加成骨細(xì)胞I型膠原蛋白的表達(dá)以及OPN的表達(dá)，且其作用與濃度密切相關(guān)，在1×10-8mol/L時，其促成骨細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)。

成骨生長肽；成骨細(xì)胞；增殖；機(jī)制

1992年Bab等人在研究骨髓再生的過程當(dāng)中從愈合的骨髓細(xì)胞中分離出來一種多肽物質(zhì)，該物質(zhì)在體內(nèi)能夠激活造血系統(tǒng)、促進(jìn)機(jī)體骨的合成代謝，而在體外則具有刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞以及成骨細(xì)胞增殖、分化的作用，故而將其命名為成骨生長肽(osteogenic growth peptide，OGP)[1-2]。目前研究證實，成骨生長肽能夠有效預(yù)防骨質(zhì)疏松，促進(jìn)機(jī)體骨折愈合，并對化療、放療后的骨髓抑制有一定的緩解作用，其臨床應(yīng)用前景十分可觀[3-4]。研究報道顯示[5]，OGP在體外具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用，但其作用機(jī)制至今尚未闡明，本研究旨在探討分析OGP對小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1由本實驗室保存，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2。培養(yǎng)中觀察細(xì)胞的形態(tài)以及培養(yǎng)基顏色的變化情況，當(dāng)顯微鏡下細(xì)胞視野在80%～90%融合時，給予傳代處理。

1.2 儀器與試劑 日本Nikon TE300倒置顯微鏡，貝克曼有限公司BECKMAN Allegra X-15R 離心機(jī)，北京鼎國生物科技有限公司35 μM細(xì)胞過濾器。

成骨生長肽購于上海益眾生物技術(shù)有限公司，其純度在97%以上。DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司，優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自GIBCO公司，胰蛋白酶購自美國Sigma公司，二甲基亞砜購自美國Sigma公司，MTT購自于美國Sigma公司，兔抗鼠I型膠原蛋白抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，生物素化山羊抗兔抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，DAB試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組：實驗分為4組：OGP 3個劑量組：OGP 1×10-12mol/L組，OGP 1×10-10mol/L組，OGP1×10-8mol/L組；對照組：正常培養(yǎng)細(xì)胞，不加入OGP藥物。每組設(shè)復(fù)孔6個。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖：將培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸，將其轉(zhuǎn)入6孔板中，細(xì)胞密度為1×107個/孔，按照上述分組加入藥物，分別處理24 h、48 h以及72 h，終止藥物作用之后，棄去培養(yǎng)基，在各孔細(xì)胞中使用0.01 mol/L PBS(pH=7.4)洗滌2次，然后加入2 mL DMEM培養(yǎng)基以及200 μL MTT，于37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后將培養(yǎng)基棄去，每孔加入450 μL DMSO，輕輕晃動溶解紫色結(jié)晶，然后將混勻后的DMSO 150 μL吸入96孔板中，繼續(xù)振蕩10 min后使用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的OD值。

1.3.3 免疫化學(xué)染色法檢測I型膠原蛋白：在6孔板中制備細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁生長良好之后使用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后分別加入1×10-8mol/L、1×10-10mol/L、1×10-12mol/L OGP，對照組不加入OGP，藥物加入之后分別培養(yǎng)24 h、48 h以及72 h后取出細(xì)胞爬片，采用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測各組I型膠原蛋白的表達(dá)情況。一抗為I型膠原蛋白兔抗鼠多克隆抗體，稀釋倍數(shù)為1:500，二抗為鏈酶親和素化山羊抗兔IgG，稀釋倍數(shù)為1:2000，使用PBS代替一抗作為陰性對照，以排除內(nèi)源性污染所導(dǎo)致的非特異性反應(yīng)，避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

細(xì)胞染色后采用圖像分析系統(tǒng)對染色情況進(jìn)行檢測，在200倍顯微鏡之下按照系統(tǒng)抽樣法隨機(jī)選擇每張切片的4個視野進(jìn)行觀察，觀察棕黃色陽性細(xì)胞顆粒的總面積以及棕黃色陽性顆粒的平均透光度，然后計算出每個切片的平均IOD值(即為陽性染色強(qiáng)度)。平均IOD=平均陽性面積×平均透光度。

1.3.4 ELISA法檢測OPN含量：OPN含量的檢測參照OPN檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行。首先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)置空白對照。在待測孔中每孔加入100 μL樣品后混勻，然后將反應(yīng)板置于37 ℃條件下90 min，除零孔外每孔加入50 μL一抗工作液，然后置于37 ℃條件下60 min。洗板，除零孔外每孔加入100 μL酶標(biāo)抗體工作液，37 ℃條件下反應(yīng)15 min，然后每孔中加入50 μL終止液后混勻，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值。

2 結(jié)果

2.1 OGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響 在24 h時，各劑量OGP對MC3T3-E1的增殖無顯著影響；作用48 h、72 h，OGP 1×10-10mol/L以及OGP 1×10-8mol/L顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖(P<0.05)，而OGP 1×10-12mol/L對MC3T3-E1細(xì)胞增殖無影響，其中OGP 1×10-8mol/L 48 h促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)。見表1。

表1 OGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響Tab.1 The effect of OGP on proliferation of osteoblast ±s)

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與OGP 10-12mol/L組比較，compared with OGP 10-12mol/L group；△P<0.05，與OGP 10-10mol/L組比較，compared with OGP 10-10mol/L group

2.2 OGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞I型膠原蛋白水平的影響 OGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞I型膠原蛋白水平的影響，見圖1、圖2，作用24 h，各組成骨細(xì)胞I型膠原蛋白IOD值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；作用48 h，OGP 10-8mol/L組細(xì)胞I型膠原蛋白IOD值顯著高于對照組(P<0.05)；作用72 h，OGP 1×10-8mol/L組以及OGP 1×10-10mol/L組細(xì)胞I型膠原蛋白IOD值均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖1 OGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞I型膠原蛋白水平的影響*P<0.05，與對照組比較Fig.1 The effect of OGP on collagen I levels of osteoblast MC3T3-E1*P<0.05，compared with control group

圖2 MC3T3-E1成骨細(xì)胞I型膠原蛋白免疫組化染色結(jié)果Fig.2 Immumohistochemical staining of collagen I in osteoblast MC3T3-E1

2.3 OGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞骨橋素(OPN)含量的影響 OGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞OPN水平的影響見圖3，作用24 h，各組成骨細(xì)胞OPN OD值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；作用48、72 h，OGP 1×10-8mol/L組以及OGP 1×10-10mol/L組細(xì)胞OPN OD值顯著高于對照組(P<0.05)。

圖3 OGP對MC3T3-E1成骨細(xì)胞OPN的影響*P<0.05，與對照組比較Fig.3 The effect of OGP on OPN of osteoblast MC3T3-E1*P<0.05，compared with control group

3 討論

成骨生長肽是一種存在于血清中的內(nèi)源性多肽，其最早于20世紀(jì)90年代由損傷后再生骨髓的培養(yǎng)基中分離純化而來。經(jīng)過十余年的研究，對其生化學(xué)以及生理學(xué)的特性已經(jīng)有了一定程度的了解，OGP及其類似物能夠促進(jìn)成骨以及骨髓的全系造血，在某些血液疾病上，OGP已經(jīng)接近臨床應(yīng)用階段[6-7]。體外研究顯示[8-9]，OGP能夠促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖，但是其作用機(jī)制至今尚未闡明。徐楊等[10]研究報道顯示，在沒有地塞米松的情況下，體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞使用OGP處理之后，在蛋白水平以及mRNA水平上均檢測到了堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素(osteocalcin)2種成骨性標(biāo)志的表達(dá)，并產(chǎn)生了鈣化結(jié)節(jié)，表明OGP促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化。并且其研究結(jié)果顯示，OGP的促成骨能力與濃度密切相關(guān)，各濃度之間的促成骨作用具有著明顯差異，OGP濃度在1×10-9mol/L時其促成骨能力最強(qiáng)。

本研究探討分析OGP對小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖作用，并探討其可能的作用機(jī)制，研究結(jié)果顯示，在24 h時，各劑量OGP對MC3T3-E1的增殖無影響；作用48 h、72 h，OGP 1×10-8mol/L以及OGP 1×10-10mol/L顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖(P<0.05)，而OGP 1×10-12mol/L對MC3T3-E1細(xì)胞增殖無影響，其中OGP 1×10-8mol/L 48 h促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)。表明OGP具有促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的能力，且其促進(jìn)增殖能力與OGP的作用時間以及濃度有關(guān)，這與國內(nèi)外相關(guān)報道相吻合[11-12]。

研究證實[13-14]，I型膠原蛋白是機(jī)體形成骨機(jī)械力量的一種主要因素，其有序排列的膠原纖維越多，則新形成的骨強(qiáng)度就越強(qiáng)，因此，分析OGP對細(xì)胞膠原蛋白合成的影響，對明確OGP促成骨能力以及作用機(jī)制有著重要的意義。本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測I型膠原蛋白的水平，研究結(jié)果顯示，作用24 h，各組成骨細(xì)胞I型膠原蛋白IOD值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；作用48 h，OGP 1×10-8mol/L組細(xì)胞I型膠原蛋白IOD值顯著高于對照組(P<0.05)；作用72 h，OGP 1×10-8mol/L組以及OGP 1×10-10mol/L組細(xì)胞I型膠原蛋白IOD值均顯著高于對照組(P<0.05)。表明OGP作用后，能夠明顯增強(qiáng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞I型膠原蛋白的表達(dá)，且其對I型膠原蛋白的促進(jìn)作用與OGP的濃度相關(guān)。成骨細(xì)胞中I型膠原蛋白表達(dá)的增加，既能夠促進(jìn)骨形成，又能夠提高新生成的骨機(jī)械力學(xué)的性能，具有重要的生理學(xué)意義。

OPN是一種分泌型的糖基化磷蛋白，它作為一種成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志，在礦化的過程中能夠調(diào)節(jié)羥磷石灰晶體的生長[15]。本研究結(jié)果顯示，作用24 h，各組成骨細(xì)胞OPN OD值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；作用48 h、72 h，OGP 1×10-8mol/L組以及OGP 1×10-10mol/L組細(xì)胞OPN OD顯著高于對照組(P<0.05)。表明OGP能夠促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞OPN的表達(dá)，提示OGP可能是通過促進(jìn)OPN表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。

綜上所述，OGP能夠明顯促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖，其可能的作用機(jī)制是增加成骨細(xì)胞I型膠原蛋白的表達(dá)以及OPN的表達(dá)，且其作用與濃度密切相關(guān)，在1×10-8mol/L時，其促成骨細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)。

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(編校：王儼儼)

Effect of OGP on osteoblast MC3T3-E1 proliferation and its possible mechanism

HAN Wan-wei,TANG Xiang,LIU Lian-zhong,YE Chun-ling,WANG Xiao-mei,YAN Jian-liang

(Department of Orthopedics, Beijing Moslem People’s Hospital, Beijing 100054, China)

ObjectiveTo investigate the effect of OGP on osteoblast MC3T3-E1 proliferation and its possible mechanism.MethodsRat osteoblasts MC3T3-E1 were routine cultured which were divided into high-, middle-, low-dose group of OGP(1×10-8, 1×10-10, 1×10-12mol/L)and control group.Proliferation of osteoblast MC3T3-E1 were detected by MTT method, collagen I level by immunohistochemical staining,and osteopontin (OPN) content by ELISA after cultured with OGP for 24 h, 48 h, and 72 h.ResultsOGP in each dose had no significant effect on proliferation of MC3T3-E1 at 24 h.OGP 10-10mol/L and OGP 1×10-8mol/L significantly improved the proliferation of MC3T3-E1 at 48h, 72 h (P<0.05), and OGP 1×10-8mol/L was the most obvious at 48 h.IOD values of collagen I had no significant difference of OGP in each dose at 24 h.IOD values of collagen I in OGP 1×10-8mol/L group was significantly higher than that of control group at 48 h (P<0.05), and IOD values of collagen I in OGP 1×10-10mol/L and OGP 1×10-8mol/L group was significantly higher than that of control group at 72 h, respectively (P<0.05).OD values of OPN had no significant difference of OGP in each dose at 24 h.OD values of OGP 1×10-10mol/L and OGP 1×10-8mol/L group was significantly higher than that of control group at 48 h, 72 h, respectively (P<0.05). ConclusionOGP can significantly promote proliferation of MC3T3-E1 osteogenic cell, its possible mechanism is to increase the expression of osteoblasts collagen I and OPN expression, and the effect is closely related to concentration, the proliferation of osteoblast MC3T3-E1 in OGP 1×10-8mol/L is fastest.

osteogenic growth peptide; osteoblast; proliferation; mechanism

韓萬偉，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：骨科，E-mail：hww123123123@163.com。

R681

A

1005-1678(2015)02-0071-04