龔星,蔣建霞

(1.湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽醫(yī)院 腫瘤科，湖北 襄陽 441000；2.南京醫(yī)科大學，江蘇 南京 210000)

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Hsulf-1在肝癌細胞系中的作用及STAT3信號通路研究

龔星1,蔣建霞2

(1.湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽醫(yī)院 腫瘤科，湖北 襄陽 441000；2.南京醫(yī)科大學，江蘇 南京 210000)

目的 基于肝癌細胞中人硫酸酯酶-1(human sulfatase-1，Hsulf-1)基因對STAT3信號通路的影響，探討Hsulf-1基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 應用RT-PCR 方法測定Hsulf-1在肝癌細胞中的表達；通過Western blot方法測定Huslf-1在HGF 加入前后對STAT3 磷酸化(p-STAT3)水平及下游蛋白的影響。結果 5-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-dC和曲古抑菌素Actrichostain A,TSA)處理HepG2細胞中Hsulf-1表達增加，且2者具有協同作用；與正常細胞相比，Hsulf-1在肝癌細胞系中(HepG2，Hep3B， Huh-7，SMMC-7221)表達水平下降，在轉染pcDNA3.1(+)/Hsulf-1以及pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA-Hsulf-1中的HepG2細胞，Hsulf-1的蛋白表達量增加，p-STAT3和c-met的表達水平下降，在未轉染組以及轉染陰性siRNA的HepG2細胞中，結論則相反。結論 Hsulf-1在肝癌細胞中表達下降； Hsulf-1在肝癌細胞中可抑制由HGF刺激的p-STAT3及下游蛋白的表達水平。

Hsulf-1；肝癌細胞系；STAT3；信號通路

原發(fā)性癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，尤其是在國內，其發(fā)病率仍居高不下，并有逐年上升的趨勢?，F階段治療主要采取手術方式，但治療效果不是很理想。因此研究開發(fā)更為有效的診斷治療手段尤為迫切，而在此基礎上深入研究肝癌的發(fā)生發(fā)展的分子機制，由此通過分子水平上干預、阻斷及逆轉其癌變的過程，提高肝癌的預防、診斷和治療水平在很大程度上已經得到人們的廣泛重視，并將成為今后的基礎[1-2]。在本研究旨在探討在肝癌細胞中人硫酸酯酶-1(human sulfatase-1，Hsulf-1)基因是否會對信號傳導子及轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路有調控的作用，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)能否介導STAT3信號通路的激活。研究將構建好的Hsulf-1和STAT3 siRNA轉染至HepG2細胞中，用Western blot方法檢測在不同條件下，其在HepG2細胞中的表達情況。采用的RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術，經G418篩選形成了表達STAT3 siRNA的肝癌細胞，其STAT3 mRNA表達及蛋白下降，而且此類細胞增殖活性明顯減弱，凋亡會增加，而無關序列的siRNA表達載體在對STAT3表達無影響，而且對于細胞增殖活性以及凋亡也無明顯影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Trizol 試劑 (湖北貝特試劑公司)；結晶紫、 MTT 試劑盒、陽離子脂質體(Lipofectin)、DMSO(Sigma，USA)；胎牛血清 (Hyclone，USA)；硝酸纖維膜(Millipore，USA)；DNA marker、 protein marker、RNA 、PCR KIT(AMV)Ver.3.0 試劑盒(TaKaRa 生物公司，日本)BCA 試劑盒(北京百泰克公司)；RIPA 強裂解液、ECL 試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，Hsulf-1、p-STAT3、STAT3、PI Sigma、cyclinD1、p-c-met、bcl-2 抗體均(SANTA CRUZ 公司，USA)；脫脂奶粉(上海光明乳業(yè))；羊抗鼠二抗(KPL公司，USA)；Taq 酶(上海生工生物技術服務有限公司)，24 孔transwell平板(corning公司，USA)；Qiagen Mid Plasmid Purification kit (Qiagen公司，德國)；紫外分光光度計(Beckman公司，USA)；超純水機(SG 公司，德國)；細胞培養(yǎng)箱 (力康生物醫(yī)療科技控股集團)；微量加樣器 (Eppendorf，Germany)Heraeus CO2細胞培養(yǎng)箱( Thermo FORMA 公司)；YXQG01 型高壓滅菌鍋(山東新華醫(yī)療器械廠)；FM130 型雪花制冰器(寧波格蘭特公司)；自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；紫外可見光分光光度計、臺式微量冷凍離心機、流式細胞儀500(Beckman Coulter 公司，USA)；PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research 公司，USA)；WD-9405B 型水平搖床、DYY-6C 型、7C 型電泳儀、DYCP-31B 型迷你水平電泳槽 (北京市六一儀器廠)；電動震蕩混合器、CS.24 型搖床(上海醫(yī)療設備廠)；PCR 擴增儀(480 型)(BIO.RAD 公司，USA)；高速多功能冷凍離心機(JOUAN公司，法國)；恒溫攪拌循環(huán)水浴箱(常州國華電器有限公司)；Alpha imagerTM1220 型紫外成像分析儀(Alpha innotech 公司，USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：肝癌細胞系(HepG2，Hep3B，Huh-7及SMMC-7221)培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。根據細胞的生長情況，及時更換培養(yǎng)液，在細胞貼壁生長達到培養(yǎng)板面積的80%～90%時，可以進行傳代，在此期間，根據細胞生長速度選擇1:2～1:4傳代。用1 mL胰酶消化液在超凈工作臺上使用，消化大約2 min，當細胞變圓后，再加入2 mL的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)用彎頭吹管將其充分吹打成單細胞的懸液后，再加入1 mL新生牛血清來終止胰酶的作用，最后按照傳代的要求加入5 mL帶血清培養(yǎng)液，分裝到新培養(yǎng)瓶里繼續(xù)培養(yǎng)，做好傳代標記。

1.2.2 5-Aza-dC及TSA處理HepG2細胞：將取對數生長期HepG2細胞，經胰酶消化后調整細胞密度為1×106個/mL以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后其中3個隨機分為5-Aza-dC組，分別加入濃度為5、2.5、1.0、0.5和0 μmol/L 5-Aza-dC；對照組只加培養(yǎng)基、LO2細胞系細胞，每組設6個復孔，另3個隨機分為5-Aza-dC、對照組和5-Aza-dC+TSA組分別加入濃度分別為0.5，0.25，0 μmol/L的TSA，和5.0 μmol/L 5-Aza-dC+0.5 μmol/L TSA組，對照組只加培養(yǎng)基、LO2細胞系細胞，每組設6個復孔。

1.2.3 RT-PCR 檢測Hsulf-1 mRNA的表達：總RNA提取：按照試劑盒說明書操作步驟提取肝癌細胞系的RNA;(逆轉錄獲得cDNA；引物設計與合成；PCR反應。

1.2.4 pcDNA3.1(+)/Hsulf-1、pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA及pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA-Hsulf-1真核表達載體的構建 以 pcDNA3.1(+)為模板，以目的基因Hsulf-1引物擴增 Hsulf-1 cDNA，反應條件: 94 ℃ 變性 2 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 60 s，35 個循環(huán); 72 ℃延伸5 min。PCR產物行BamHⅠ+SalⅠ雙酶切，插入到質粒載體 pcDNA3.1的多克隆位點區(qū)，構建pcDNA3.1(+)/Hsulf-1。

1.2.5 SDS-PAGE電泳：收集細胞按1×107個/mL加入RIPA細胞裂解液，BCA法測蛋白濃度。按每孔蛋白上樣總量為20 μg制備樣品，十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干式電轉印至PVDF膜上，按Western blot常規(guī)操作行Hsulf-1蛋白和p-STAT3蛋白檢測，X光片用Mixrotek ScanWizard5掃描軟件進行電腦掃描、Quantity one 7.0圖像分析軟件作灰度分析。

1.2.6 HGF處理HepG2細胞：將取對數生長期HepG2細胞，經胰酶消化后調整細胞密度為1×106個/mL以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后其中隨機分為加入濃度分別為5 ng/mL HGF，對照組只加培養(yǎng)基、細胞，每組設6個復孔，在不同時間段(0，1 h)觀察并檢測其蛋白表達情況。

2 結果

2.1 通過5-aza-dC及TSA處理HepG2細胞后Hsulf-1的表達 當研究將不同濃度的5-aza-dC 加入到HepG2細胞后，Hsulf-1隨著藥物濃度的增加而表達上升，同樣的結果出現在加入TSA后，TSA濃度的增加使得Hsulf-1的表達同樣上升，將5.0 μmol/L 5-aza-dC以及0.5 μmol/L TSA同時加入到HepG2細胞后，Hsulf-1的表達量較前2者單獨的效果更高。見圖1。

圖1 5-aza-dC及TSA處理HepG2細胞后Hsulf-1的表達Fig.1 The expression of Hsulf-1in HepG2 cells treated by TSA and 5-aza-dC

分別將0、0.5、1.0、2.5、5.0 μmol/L 5-aza-dC加入到HepG2細胞后，Hsulf-1 表達量隨藥物濃度增加而提高；將0、0.25、0.5 μmol/L TSA加入到HepG2細胞得到同樣的結果，而同時加入5.0 μmol/L 5-aza-dC以及0.5 μmol/L TSA后，Hsulf-1表達量分別與前2者單獨處理后更高。

2.2 RT-PCR 檢測Hsulf-1 基因mRNA的表達結果 應用RT-PCR方法，在所測的4種肝癌細胞系中(HepG2、Hep3B、Huh-7及SMMC-7221)，Hsulf-1基因mRNA的表達水平全部下降，且下降明顯，以正常肝細胞作為對比。這與前期他人在肝癌細胞系中的研究結果相同[3]。Hsulf-1 mRNA的表達量用所測肝癌細胞系及正常肝細胞LO2細胞系中的mRNA的灰度值與內參照GAPDH的灰度值做比值進行表示。見圖2。

圖2 RT-PCR方法檢測肝癌細胞系、對照組中Hsulf-1 mRNA的表達情況*P< 0.05，與對照組相比Fig.2 Expression of Hsulf-1mRNA in hepatocellular carcinoma cell line and the control group detected by RJ-pck*P< 0.05，compared with control group

2.3 Western blot檢測轉染Hsulf-1蛋白以及p-STAT3蛋白 研究成功轉染pcDNA3.1(+)/Hsulf-1、pcDNA3.1(+)/STAT3 siRNA及pcDNA3.1(+)/STAT3 siRNA-Hsulf-1，并應用Western blot分析檢測。在未轉染組以及轉染空質粒的HepG2細胞中，Hsulf-1的表達受到抑制，沒有呈現高表達狀態(tài)，而轉染pcDNA3.1(+)/Hsulf-1以及pcDNA3.1(+)/STAT3 siRNA-Hsulf-1后的HepG2細胞中，Hsulf-1的蛋白表達量增加，檢測STAT3磷酸化表達在轉染細胞中的情況，在未轉染組以及轉染陰性siRNA的HepG2細胞中，STAT3 磷酸化的表達未受影響，呈現高表達，而在pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA以及pcDNA3.1(+)/STAT3siRNA-Hsulf-1后的HepG2細胞中，STAT3磷酸化表達下降，結果表明轉染成功。見圖3。

圖3 Western blotting檢測 Huslf-1表達質粒及STAT3 siRNA轉染情況Fig.3 The method of western blot for detection the expression of Hsulf-1 in and transfection conditions of STAT3 siRNA

2.4 Hsulf-1在HepG2細胞系中抑制STAT3 磷酸化的表達水平 在HepG2細胞系中，Hsulf-1的表達可減少STAT3磷酸的表達水平，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)，但是卻不影響STAT3總量。將HGF 加入到HepG2 非表達Hsulf-1細胞系中，研究發(fā)現p-STAT3及c-met的表達水平同時上升，但是如將HGF 加入到在HepG2 表達Hsulf-1細胞系中，則結果完全不同，STAT3及c-met的磷酸化表達水平開始得到抑制。見圖4。

圖4 Hsulf-1在HepG2細胞系中對STAT3 信號的影響*p<0.05,與對照組相比Fig.4 The effect of Hsulf-1 on STAT3 signal in HepG2 cell line*p<0.05,compared with control group

當成功轉染Hsulf-1后，應用Western blotting 檢測p-STAT3及總STAT3蛋白的表達情況，并與對照組定量分析p-STAT3蛋白含量，以p-STAT3/β-actin 作為比值進行分析，差異有統計學意義(P<0.01)；在HepG2 非表達Hsulf-1細胞系中加入5 ng/mL HGF 1 h后，p-c-met及p-STAT3的表達均隨時間增加，而在Hsulf-1-轉染細胞系中，2者的含量同時減少。

3 討論

由研究可知，Hsulf-1在肝癌細胞系中呈現低表達狀態(tài)，質粒轉染后可促進 Hsulf-1蛋白表達升高，Hsulf-1可能通過降低 HSPGs的硫酸化程度，影響酪氨酸激酶活性，進一步抑制了多種信號通路的表達，腫瘤細胞出現增殖減慢、凋亡增加、侵襲性降低等有關，這與前期的研究相符，研究證實，Hsulf-1 參與調控多種細胞因子信號通路的表達。Liu等[12]將攜帶 Hsulf-1 片段的病毒轉染肺癌細胞株 H292，發(fā)現 AKT、ERT 信號途徑的表達下調，細胞遷移、增殖能力下降。研究證實[3]在肝癌細胞株研究中也發(fā)現，Hsulf-1的過表達可以使AKT、ERT的磷酸化水平降低，抑制該通路的表達。而Hsulf-1在多項研究中也表明可以通過水解HSPGS來調控多種信號通路，如MAPK 信號以及PI3K/AKT信號[4-6]等，但是目前尚未見報道Hsulf-1是否對STAT3信號通路有影響，為了進一步研究STAT3信號通路在HepG2細胞中的影響，研究構建了pcDNA3.1(+)/Hsulf-1 、pcDNA3.1(+)/STAT3 siRNA及pcDNA3.1(+)/STAT3 siRNA-Hsulf-1，并將其轉入到HepG2細胞中，取名為Hsulf-1轉染組，STAT3 siRNA組以及Hsulf-1轉染+STAT3 siRNA組，本研究結果證實，Hsulf-1的表達可減少STAT3磷酸的表達水平，HGF可以促進非表達Hsulf-1細胞系中p-STAT3及c-met的表達水平上升，而在表達Hsulf-1細胞系中得到抑制。目前研究發(fā)現[7-10]STAT3信號轉導通路是一類十分重要的信號通路，可調控細胞增殖、分化及凋亡等等的過程，其被激活的途徑目前有兩種，其中一種是在由細胞外的各種刺激信號，比較常見的是細胞因子IFN，IL-6等，它們會與細胞表面的相應受體進行結合，接下來進一步在細胞表面進行聚集并激活。但是由于缺乏內源性酪氨酸激酶活性，胞漿內的酪氨酸激酶的家族就會相應的被募集，比如說JAK家族[11-13]。JAK家族包括JAKl，JAK2及JAK3等，它們每個可激活的受體種類不同。在配體與受體結合后，并且受體通過募集其相應的JAK在磷酸化后，受體尾部的酪氨酸磷酸化。然后其與SH2結構域之間產生反應，并且STAT3激活。

而STAT3被募集后，它們會被磷酸化，接著就會形成二聚體，然后迅速進入核內，通過與其靶基因上的DNA進行結合，誘導基因轉錄。而另外有一個STAT3的激活途徑，這種途徑與細胞因子受體信號不同，活化生長因子受體也具有內源性的酪氨酸激酶活性，可以將STAT3進行磷酸化。比如有研究證實[14-15]EGFR可以將STAT3蛋白磷酸化[16]。不僅如此，一些其他的酪氨酸激酶如Src，Abl也可以將STAT3蛋白磷酸化。因此，STAT3蛋白可以被多種不同酪氨酸激酶激活。而STAT3可以穩(wěn)定長期的表達此種效應，從而調控細胞生理功能。

外源性Hsulf-1基因能夠抑制肝癌細胞系中呈現低表達狀態(tài)，向腫瘤細胞中導入Hsulf-1基因會減少STAT3磷酸的表達水平，抑制其下游p-STAT3及c-met的表達水平，可以抑制腫瘤細胞生長和轉移，促進腫瘤細胞凋亡。因此采用靶向Hsulf-1基因的治療策略，能同時抑制腫瘤細胞的增殖與遷移，在一定程度上遏制了腫瘤無限制生長。由此可見，Hsulf-1基因作為一個很有潛力的抗癌基因，為臨床上腫瘤的基因治療提供了新的分子靶標。

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(編校：王冬梅)

Role of Hsulf-1 in hepatocellular carcinoma cell lines and STAT3 signaling pathway research

GONG Xing1,JIANG Jian-xia2

(1.Department of Oncology, Affiliated Xiangyang Hospital of Hubei Medical College, Xiangyang 441000, China; 2.Nanjing Medical University, Nanjing 210000, China)

ObjectiveTo investigate the role of Hsulf-1 gene in the occurrence and development of hepatocellular carcinoma based on effect of Hsulf-1 gene on STAT3 signaling pathway.MethodsRT-PCR method was used for determination of the expression of Hsulf-1 in hepatocellular carcinoma cells; Determination of Huslf-1 in HGF before and after adding on the phosphorylation of STAT3 by Western blot method (p-STAT3) level and the effect of downstream proteins.ResultsExpression of Hsulf-1 was increased by 5-Aza-dC and TSA treatment in HepG2 cells, which had synergistic effect.Compared with normal cells, expression levels of Hsulf-1 in HCC cell lines decreased(HepG2,Hep3B,Huh-7,SMMC-7221),but in the transfected, pcDNA3.1 (+) /Hsulf-1 and pcDNA3.1 (+) /STAT3siRNA-Hsulf-1 in HepG2 cells which was increased in expression of Hsulf-1 protein,the expression level of p-STAT3 and c-Met decreased in untransfected and transfected, siRNA negative HepG2 cells, while the opposite. ConclusionThe expression of Hsulf-1 decreased in HCC cells; Hsulf-1 can inhibit the expression of p-STAT3 and downstream protein level by stimulation of HGF in hepatocellular cancer cells.

human sulfatase-1; hepatocellular carcinoma; STAT3; signaling pathway

國家自然科學基金(81101800)

龔星，男，學士，主治醫(yī)師，研究方向：肺癌的生物靶向治療，E-mail：qch1821460052.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)02-0048-04