戚利坤,王俊,劉洪澤,張聲林,蔡浩,洪鳴

(1.青海省第五人民醫(yī)院 腫瘤外科，青海 西寧 810007；2.南京醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇 南京 210029)

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開口箭對(duì)S-180細(xì)胞和實(shí)體瘤的抑制作用研究

戚利坤1,王俊1,劉洪澤1,張聲林1,蔡浩1,洪鳴2

(1.青海省第五人民醫(yī)院 腫瘤外科，青海 西寧 810007；2.南京醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)部，江蘇 南京 210029)

目的 研究開口箭(Tupistra chinensis Baker)對(duì)S-180細(xì)胞及其實(shí)體瘤的抑制作用。方法 SPF級(jí)BALB/c-nu小鼠30只，將腫瘤生長(zhǎng)良好且小鼠精神狀態(tài)佳者進(jìn)行隨機(jī)分為5組，每組6只：生理鹽水組，開口箭低劑量組，開口箭中劑量組，開口箭高劑量組，環(huán)磷酰胺(cytoxan,CTX)組。觀察細(xì)胞形態(tài)變化及實(shí)體瘤生長(zhǎng)狀況；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組S-180細(xì)胞DNA含量及周期，比較各組對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響；利用透射電鏡觀察開口箭干預(yù)各組實(shí)體瘤細(xì)胞超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)S-180細(xì)胞呈圓形或橢圓形，于接種第10天剝?nèi)?shí)體瘤，瘤體組織生長(zhǎng)良好；開口箭將S-180細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯在S期；電鏡下開口箭各組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)凝聚、邊緣化，細(xì)胞核固縮，與生理鹽水組和CTX組比較有明顯結(jié)構(gòu)改變。結(jié)論 開口箭對(duì)S-180細(xì)胞及其實(shí)體瘤均有明顯抑制作用，開口箭阻滯S-180細(xì)胞生長(zhǎng)周期，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的變化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

開口箭；S-180細(xì)胞；抗腫瘤機(jī)制

隨著分子生物學(xué)和分子藥理學(xué)在中藥單方和復(fù)方領(lǐng)域的廣泛開展，中藥制劑已從宏觀到微觀，從整體到局部，從整體—部位—成分3個(gè)化學(xué)層次、從整體動(dòng)物—組織器官—細(xì)胞—分子基因4個(gè)藥理水平確定藥效物質(zhì)；通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)分析技術(shù)，血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)分析方法，譜效關(guān)系分析，生物色譜技術(shù)，蛋白質(zhì)組、基因組學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)等研究方法[1]，成功研究出生物堿類、萜類、皂苷類、甾體類、黃酮類、蒽醌類、鞣質(zhì)類等主要有效成分及其衍生物的藥效基團(tuán)[2]。大量研究總結(jié)認(rèn)為中藥抗腫瘤的作用機(jī)制主要有：抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤藥物的多耐藥性，抑制腫瘤血管的生成，抗氧化作用，抑制腫瘤細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，抑制直接細(xì)胞毒作用，阻斷腫瘤細(xì)胞遷移通路及基因水平調(diào)節(jié)以及增強(qiáng)機(jī)體的免疫力等等[3-7]。本文以具有清熱解毒、散瘀止痛、益氣活血等多種功效的開口箭為研究對(duì)象，探討其對(duì)S-180肉瘤細(xì)胞抑制作用，探討清熱解毒類中藥—開口箭抑制腫瘤的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 S-180細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 S-180細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)生物典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)；SPF級(jí)BALB/c-nu小鼠30只，雌性，4～6 w，平均體質(zhì)量16～20 g，購(gòu)于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)：SCK鄂2008-0004)，在中南醫(yī)院動(dòng)物中心喂養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.2 主要試劑 RPMI1640美國(guó)GIBCO公司；胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司；開口箭飲片渦陽縣源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司；環(huán)磷酰胺200 mg/支(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)11013121)；氟尿嘧啶250 mg/10mL(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)1012221)；焦碳酸二乙酯(DEPC)美國(guó)Sigma公司；二苯基四氮唑溴鹽(MTT)碧云天生物技術(shù)研究所；DMSO(二甲基亞砜)；化學(xué)發(fā)光法EMSA試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 開口箭藥物制備：稱取開口箭飲片(神農(nóng)架產(chǎn)區(qū))0.5 kg，自來水浸泡30 min，分煎2次得濃度為0.16 g/mL溶液，冷卻后用無菌紗布過濾2次，分瓶置4 ℃保存，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.22 μM微孔針頭濾器過濾，并用蒸餾水或者PBS調(diào)整至需要濃度，體內(nèi)灌胃時(shí)提前30 min移至室溫。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將腫瘤生長(zhǎng)良好且小鼠精神狀態(tài)佳者進(jìn)行隨機(jī)分為5組，每組6只。生理鹽水組，在普食的基礎(chǔ)上給予生理鹽水灌胃；開口箭低劑量組，在普食的基礎(chǔ)上給予開口箭0.5 g/kg；開口箭中劑量組，在普食的基礎(chǔ)上給予開口箭1 g/kg；開口箭高劑量組，在普食的基礎(chǔ)上給予開口箭2 g/kg；以上各組均為灌胃給藥。CTX組，在普食的基礎(chǔ)上按體質(zhì)量給予環(huán)磷酰胺0.02 g/kg腹腔注射[8]。每天1次，干預(yù)2周后，乙醚麻醉剝?nèi)∧[瘤，并行相關(guān)形態(tài)學(xué)和生化檢測(cè)。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)S-180細(xì)胞DNA含量及其周期：收集懸浮細(xì)胞于5 mL離心管中，1200 r/min離心5 min；倒掉上清液，每管加入1 mL 14 ℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞；轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管，以1200 r/min，5 min沉淀細(xì)胞；倒掉上清液，并輕彈管底，每管加入1 mL 14 ℃預(yù)冷的75%乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定過夜；以1500 r/min，5 min沉淀細(xì)胞，倒掉上清液，并予1 mL 14 ℃預(yù)冷的PBS，1500 r/min離心5 min，清洗細(xì)胞2次；輕彈管底分散細(xì)胞，每管加入0.5 mL的碘化丙啶染色液(加入前約5 min按6個(gè)樣本的量配制)，輕輕吹打細(xì)胞懸液，37 ℃孵育30 min后；用200目篩網(wǎng)過濾，并轉(zhuǎn)移至流式管后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 電鏡切片制作[9]：在無菌條件下取出腫瘤組織，去胞膜，將其切成5 mm方形，用2.5%戊二醛固定液前固定2 h后，用0.1M磷酸緩沖液漂洗3次，然后用1%鋨酸后固定90 min，pH 7.2～7.4，固定完畢，用緩沖液漂洗20 min后分別用50%、70%、80%乙醇各1次，每次各15 min，100%乙醇2次，每次15 min進(jìn)行梯度脫水，然后環(huán)氧樹脂812包埋，最后用枸櫞酸鉛進(jìn)行切片染色。

2 結(jié)果

2.1 S-180肉瘤細(xì)胞及其實(shí)體瘤生長(zhǎng)狀況 S-180肉瘤細(xì)胞呈圓形或橢圓形，均勻懸浮在培養(yǎng)瓶中，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，平均每1～2 d傳一代。肉瘤細(xì)胞接種BALB/c-nu小鼠后于第5 d可見實(shí)體瘤突起，于接種第10 d剝?nèi)?shí)體瘤，瘤體組織生長(zhǎng)狀態(tài)良好。見圖1。

圖1 S-180肉瘤細(xì)胞及其實(shí)體瘤生長(zhǎng)狀況Fig.1 The growth status of S-180sarcoma cells and solid tumor

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)S-180細(xì)胞周期 碘化丙啶染液能夠透過凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞膜，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度使細(xì)胞核紅染，結(jié)合細(xì)胞的DNA含量分析，可確定凋亡的細(xì)胞所處的細(xì)胞周期。由表1可知開口箭對(duì)S-180細(xì)胞生長(zhǎng)周期的阻滯在S期，而且隨著濃度的增加阻滯在S期的比例越大，說明開口箭可阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)，誘發(fā)S-180肉瘤細(xì)胞的凋亡。見表1。

表1 開口箭對(duì)S-180細(xì)胞周期的影響Tab.1 Effect of Tupistra chinensis on S-180 cell cycle

2.3 透射電鏡實(shí)體瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 凋亡是細(xì)胞受基因調(diào)控的一種自然死亡過程，是多細(xì)胞生物生命活動(dòng)中不可缺少的過程。從形態(tài)學(xué)上認(rèn)定細(xì)胞變化是最直接判定細(xì)胞凋亡的方法。電鏡下可見對(duì)照組實(shí)體瘤細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)，甚者有細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，可見凋亡小體；開口箭各組細(xì)胞體積無明顯縮小，細(xì)胞核染色質(zhì)無明顯凝聚邊緣化，低、中、高劑量組隨著劑量的增加，細(xì)胞變化與陽性對(duì)照組越接近，見圖2。

圖2 電鏡下各組實(shí)體瘤超微結(jié)構(gòu)改變Fig.2 Ultrastructural changes of solid tumor groups under electron microscopy

3 討論

現(xiàn)代化研究認(rèn)為中藥抗腫瘤機(jī)制與多因素有關(guān)。高靜東等[12]研究認(rèn)為清熱解毒中藥具有下調(diào)MMP-9表達(dá)及上調(diào)TIMP-1表達(dá)的作用,與養(yǎng)陰、補(bǔ)腎、健脾類中藥相比有顯著性差異。臨床也有諸如白花敗醬草提取物對(duì)小鼠U14宮頸癌細(xì)胞的抑制作用，認(rèn)為可能與其調(diào)節(jié)小鼠免疫功能，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)酶活性有關(guān)[13]。連翹提物物對(duì)大腸癌、胃癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞均抑制作用，半數(shù)抑制濃度平均值為191.88 μg/mL，分析可能與下調(diào)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Survivin mRNA和Bel-2mRNA有關(guān)[14]。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)開口箭對(duì)S-180細(xì)胞抑制作用，認(rèn)為開口箭對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，可明顯抑制S-180肉瘤細(xì)胞的增值，阻滯其生長(zhǎng)周期。開口箭抗腫瘤的具體有效成分和分子機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

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(編校：譚玲)

Study on Tupistra Chinensis Baker’s role on inhibiting S-180 cell and solid tumors

QI Li-kun1,WANG Jun1,LIU Hong-ze1,ZHANG Sheng-lin1,CAI Hao1,HONG Ming2

(1.Department of Surgical Oncology, The Fifth People’s Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, China; 2.Department of Medical Sciences, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo study the Tupistra chinensis Baker’s inhibition on S-180 cells and solid tumors.MethodsSPF 30 BALB/c-nu mice, the tumor growth in mice and good mental state better were randomly divided into 5 groups, 6 rats in each group: normal saline group, Tupistra chinensis Baker low dose group, middle dose group, high dose group, CTX group.The morphological changes of cells and solid tumor growth status were observed;S-180 DNA content and cell cycle in each group were detected by flow cytometry,the changes of ultrastructure of each intervention group were observed by transmission electron microscope.ResultsThe experimental results showed that the S-180 cells were round or oval, inoculation in article 10 d stripping of solid tumors, tumor tissue growth was good; cells were irregular under electron microscope,chromatin condensation and marginalization, karyopyknosis, which had a significant structural change compared with normal saline group and CTX group. ConclusionTupistra chinensis Baker has inhibitory action on S-180 sarcoma cells and solid tumor.Tupistra chinensis Baker-could block S-180 cell cycle, resulting in changes in cell morphology, inducing tumor cell apoptosis.

Tupistra chinensis Baker; S-180 cells; antitumor mechanism

國(guó)家自然科學(xué)基金(81100352)

戚利坤，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤學(xué)，E-mail：qch1821460066@163.com。

R2-031

A

1005-1678(2015)02-0045-03