張子雯,傅小一

(江西省宜春學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，江西 宜春 336000)

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miR-27a對(duì)兩種結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

張子雯,傅小一

(江西省宜春學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，江西 宜春 336000)

目的 探討microRNA-27a(miR-27a)對(duì)2種結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法 應(yīng)用miR-27a反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)在體外轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116，設(shè)置轉(zhuǎn)染無義序列組作為對(duì)照組。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-27a表達(dá)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力；Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞FOXO1蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-27a ASO后結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116的miR-27a表達(dá)水平均明顯降低(P<0.001)，增殖能力和侵襲能力均受到明顯抑制(P<0.01)，F(xiàn)OXO1蛋白表達(dá)均明顯增高(P<0.05)。結(jié)論 抑制miR-27a表達(dá)可顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116的增殖能力和侵襲能力，而調(diào)控下游FOXO1蛋白表達(dá)可能是miR-27a參與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的主要機(jī)制。

miR-27a；結(jié)腸癌；增殖；侵襲；FOXO1

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。近年來，隨著人們生活方式及飲食習(xí)慣的改變，國(guó)內(nèi)外結(jié)腸癌發(fā)病率及死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。但目前對(duì)于結(jié)腸癌增殖及侵襲的機(jī)制尚未完全明確。非蛋白質(zhì)編碼微小RNA(microRNA， miRNA)的出現(xiàn)為惡性腫瘤的研究提供了新思路[2]。越來越多證據(jù)顯示，miRNA與腫瘤密切相關(guān)，miRNA可通過與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)，從而調(diào)控蛋白翻譯過程，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡和基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用[3]。大量研究證實(shí)，miR-27a在胃癌、乳腺癌組織中表達(dá)明顯上升，并可通過調(diào)控其下游蛋白表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，但miR-27a在結(jié)腸癌中的作用和機(jī)制尚未見報(bào)道[4-5]。本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116為研究對(duì)象，利用反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides， ASO)技術(shù)抑制細(xì)胞中miR-27a表達(dá)，觀察miR-27a低表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，旨在為結(jié)腸癌臨床治療提供可靠的基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116(ATCC細(xì)胞庫(kù)，美國(guó))；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液(Hyclon公司)；脂質(zhì)體Lipofectamin 2000(Invitrogen，美國(guó))；miR-27a ASO(Applied Biosystems，美國(guó))；總蛋白定量測(cè)試盒(南京建成，中國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116，無血清RPMI1640洗滌3次，RPMI1640培養(yǎng)基(1%雙抗，10%胎牛血清)重懸浮細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液一次。

1.3 轉(zhuǎn)染 待結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液加至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采用脂質(zhì)體Lipofectamin 2000分別將無義序列(Control)和miR-27a ASO轉(zhuǎn)染至SW620和HCT116細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染終濃度為80 nmol/L，轉(zhuǎn)染6 h換液，48 h后收集細(xì)胞，備用。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequence

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL，加入96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，培養(yǎng)板置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h；分別轉(zhuǎn)染無義序列(Control)和miR-27a ASO，轉(zhuǎn)染終濃度為80 nmol/L，轉(zhuǎn)染6 h換液，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入50 μL MTT工作液(2 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，離心棄上清，每孔加入150 μL DMSO(4% 1.0 M HCl)，OD450nm讀值，每組設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。

1.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 RPMI1640培養(yǎng)基(1%雙抗，10%胎牛血清)加至24孔板，600 μL/孔；于小室基膜上預(yù)鋪設(shè)基質(zhì)膠，將Transwell小室置于24孔板，靜置5 min，收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞并分別接種于小室，各小室接種細(xì)胞數(shù)量為5×104個(gè)/mL。細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h，取出小室，擦去小室基膜表面細(xì)胞，95%酒精室溫固定15 min，結(jié)晶紫室溫染色10 min，隨機(jī)選取3個(gè)視野于高倍鏡下計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測(cè)FOXO1蛋白表達(dá) 分別收集無義序列(Control)和miR-27a ASO轉(zhuǎn)染后的SW620和HCT116細(xì)胞，PMSF裂解液提取細(xì)胞總蛋白，總蛋白定量測(cè)試盒測(cè)定總蛋白濃度，按4:1比例分別加入5×loading buffer和蛋白樣品，煮沸3 min，配制聚丙烯酰胺凝膠，上樣，跑膠1.5 h，0 ℃ 100 V轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂乳室溫封閉1.5 h，F(xiàn)OXO1抗體稀釋1000倍后4 ℃孵育過夜，洗膜3次，二抗孵育2 h，ECL試劑顯色，進(jìn)行蛋白表達(dá)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-27a ASO對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116 miR-27a表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染無義序列(Control)相比較，轉(zhuǎn)染 miR-27a ASO后結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116的miR-27a表達(dá)水平明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染miR-27a ASO后結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116 miR-27a表達(dá)情況***P<0.001，與對(duì)照組比較Fig.1 Expression of miR-27a in colorectal cancer cells of SW620 and HCT116 transfected with miR-27a ASO***P<0.001, compared with control group

2.2 抑制miR-27a表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116增殖水平的影響 MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染無義序列(Control)相比較，轉(zhuǎn)染miR-27a ASO可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116增殖水平，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2、圖3。

圖2 抑制miR-27a表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620增殖水平的影響**P<0.01，***P<0.001，與對(duì)照組比較Fig.2 The effect of miR-27a expression inhibited on proliferation of colorectal cancer cells of SW620**P<0.01，***P<0.001，compared with control group

圖3 抑制miR-27a表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116增殖水平的影響**P<0.01，***P<0.001，與對(duì)照組比較Fig.3 The effect of miR-27a expression inhibited on proliferation of colorectal cancer cells of HCT116**P<0.01, ***P<0.001，compared with control group

2.3 抑制miR-27a表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116侵襲能力的影響 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染無義序列(Control)相比較，轉(zhuǎn)染miR-27a ASO可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116侵襲能力，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖4。

圖4 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The experimental results of transwell chambers

2.4 抑制miR-27a表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116 FOXO1蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染無義序列(Control)相比較，轉(zhuǎn)染miR-27a ASO可明顯上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116 FOXO1蛋白表達(dá)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5、圖6。

圖5 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620 FOXO1蛋白表達(dá)情況Fig.5 The expression of FOXO1 protein in colorectal cancer cells of SW620

圖6 結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 FOXO1蛋白表達(dá)情況Fig.6 The expression of FOXO1 protein in colorectal cancer cells of HCT116

3 討論

由于發(fā)病隱匿，大多數(shù)結(jié)腸癌患者確診時(shí)已為晚期，以放化療為主的綜合治療手段效果欠佳，尋找新的治療手段是提高結(jié)腸癌患者總生存期的關(guān)鍵[6-7]。增殖和侵襲是惡性腫瘤最為明顯的生物學(xué)特性，也是惡性腫瘤難以治愈的根本原因。如何抑制惡性腫瘤增殖和侵襲能力對(duì)控制惡性腫瘤進(jìn)展和提高存活率具有重要意義[8-10]。腫瘤的增殖和侵襲是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，miRNA對(duì)腫瘤增殖和侵襲相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用是目前研究的熱點(diǎn)[11]。

miRNA是一類具有基因調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著雙向調(diào)節(jié)作用，一方面miRNA可作為抑癌基因抑制促癌相關(guān)蛋白表達(dá)，另一方面miRNA又可作為促癌基因抑制抑癌相關(guān)蛋白表達(dá)[12]。研究證實(shí)，miR-27a在乳腺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，并可通過抑制下游基因Myt-1和ZBTB10表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[13]。抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞miR-27a表達(dá)，可明顯增加FOXO1表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)細(xì)胞在G1期停滯并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。在胰腺癌中，miR-27a可通過靶向調(diào)控胰腺癌細(xì)胞Sprouty2蛋白表達(dá)，參與細(xì)胞增殖過程[15]。上述證據(jù)提示miR-27a可能在惡性腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮癌基因功能。本研究結(jié)果顯示，miR-27a在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116中表達(dá)水平明顯增加，提示miR-27a在結(jié)腸癌中起致癌作用。進(jìn)一步研究證實(shí)，采用miR-27a ASO可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116中miR-27a表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞的增殖和侵襲能力均被明顯抑制，這也為證實(shí)miR-27a在結(jié)腸癌中發(fā)揮致癌作用提供了有力佐證。

FOXO1作為FOXO家族成員，在腎癌、乳腺癌、前列腺及子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤中均呈低表達(dá)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，F(xiàn)OXO1高表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯；而FOXO1低表達(dá)則可促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡[16-18]。研究顯示，T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)和β-catenin在結(jié)腸癌的發(fā)展中其關(guān)鍵作用，F(xiàn)OXO1則可通過與β-catenin相結(jié)合阻止其與TCF相互作用，使細(xì)胞周期停滯，從而抑制結(jié)腸癌發(fā)展，故有學(xué)者提出，重新激活FOXO1活性可能是治療結(jié)腸癌的一種新策略[19]。本研究結(jié)果顯示，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞miR-27a表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞FOXO1蛋白表達(dá)水平顯著提高，同時(shí)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力和侵襲能力顯著降低，故推測(cè)miR-27a可能是通過調(diào)控下游基因FOXO1表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的調(diào)節(jié)作用，但其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，抑制miR-27a表達(dá)可顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116的增殖能力和侵襲能力，而調(diào)控下游FOXO1蛋白表達(dá)可能是miR-27a參與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的主要機(jī)制，抑制miR-27a表達(dá)可作為臨床治療結(jié)腸癌的新思路。

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(編校：王儼儼，吳茜)

Effect of miR-27a on the proliferation and invasion of two colorectal cancer cells

ZHANG Zi-wen,FU Xiao-yi

(College of Medicine, Yichun University, Yichun 336000, China)

ObjectiveTo evaluate effect of miR-27a on proliferation and invasion of colorectal cancer cells. MethodsThe colorectal cancer cells of SW620 and HCT116 were transfected with miR-27a antisense oligonucleotides (ASO) in vitro, and the above cells transfected with nonsense sequence were as control group. RT-PCR was used to examine the expression levels of miR-27a. MTT method was used to examine the cell proliferation. Transwell matrigel invasion test was used to examine the cell invasion. Western blot was used to examine the protein expression levels of FOXO1. ResultsCompared with control group, after the colorectal cancer cells of SW620 and HCT116 were transfected with miR-27a ASO, the expression levels of miR-27a significant decreased(P<0.001), the ability of proliferation and invasion significant inhibited(P<0.01), the protein expression levels of FOXO1 significant increased(P<0.05). ConclusionInhibiting miR-27a expression could significantly reduce the proliferation ability and invasion ability of SW620 and HCT116. The regulation of downstream FOXO1 protein expression may be the main mechanisms of miR-27a involved in cdorectal cancer cell proliferation and invasion.

miR-27a; FOXO1; colorectal cancer; proliferation; invasion

張子雯，女，本科，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向:病理實(shí)驗(yàn)教學(xué)與病理技術(shù)研究，E-mail：2230214069@qq.com；傅小一，通訊作者，男，本科，副主任醫(yī)師、副教授，研究方向:病理教學(xué)與科研，E-mail：ycfxylhl119@163.com。

R735.3

A

1005-1678(2015)02-0024-04