趙志武,師磊,陳顯久,王君實,馬敏,燕炯Δ

(1.山西醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，山西 太原 030001 )

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MCHR1基因shRNA真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

趙志武1,師磊1,陳顯久2,王君實1,馬敏1,燕炯1Δ

(1.山西醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，山西 太原 030001 )

目的 構(gòu)建有效針對小鼠黑色素濃集激素受體1(melanin-concentrating hormone receptor 1，MCHR1)的shRNA(small hairpin RNA)真核表達載體。方法 設計合成3條小鼠MCHR1基因的shRNA序列以及1條無同源性的shRNA序列作為陰性對照，與質(zhì)粒重組構(gòu)建sh-MCHR1干擾載體，并進行菌液PCR和DNA測序鑒定；脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠3T3-L1細胞后觀察MCHR1 mRNA和蛋白表達的變化。結(jié)果 經(jīng)菌液PCR及DNA測序鑒定表明各shRNA載體構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞后，與空載體組相比，陰性對照組MCHR1 mRNA和蛋白的表達均無明顯差異，但實驗組3種干擾載體均能顯著抑制MCHR1 mRNA和蛋白的表達(P<0.05)，且3種載體的抑制程度有一定的差異，以sh-MCHR1-1載體沉默效果最佳。結(jié)論 sh-MCHR1干擾載體構(gòu)建成功，為進一步探究MCHR1與肥胖癥之間的關系奠定了實驗基礎。

黑色素濃集激素受體1；RNA干擾；shRNA載體；3T3-L1前脂肪細胞

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，生活水平的提高，肥胖人數(shù)逐年增長，并已成為全球性公共衛(wèi)生問題。研究認為，黑色素濃集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)是一種增強食欲的神經(jīng)肽，參與機體能量代謝調(diào)節(jié)，與肥胖癥的發(fā)生相關[1-2]。MCH有2種受體亞型，即MCHR1和MCHR2，為肥胖癥藥物治療研究提供了新靶點[3-4]。其中，在嚙齒類動物體內(nèi)，MCH只通過MCHR1發(fā)揮作用，并且鼠MCHR1基因序列與人的高度同源，為研究MCH與肥胖之間的關系提供了便利條件。

RNA干擾作為一種基因沉默技術，可通過雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)同源mRNA高效特異地降解[5]。如今，該技術已廣泛應用于生物醫(yī)藥領域，成為研究基因功能和制備基因藥物的重要方法。本實驗旨在通過采用RNA干擾技術制備MCHR1基因shRNA真核表達載體，為進一步探究MCHR1的功能提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1 細胞株：小鼠3T3-L1前脂肪細胞由山西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科惠贈。

1.1.2 主要試劑：T4 DNA連接酶、BamHⅠ和Hind Ⅲ雙切酶(美國NEB公司)；Lipofectamine LTX&PLUS(美國Invitrogen公司)；MCHR1一抗(美國Santa Cruz公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、BCA試劑盒、HRP羊抗兔IgG二抗和ECL發(fā)光底物(武漢博士德生物工程有限公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化公司)；Premix TaqTM(大連寶生物工程有限公司)；引物序列(上海生工公司)；GV102質(zhì)粒及其通用引物由上海吉凱基因化學技術有限公司設計合成。

1.1.3 主要儀器：NAPCO-5410型恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Precision Scientific公司)；YD-S-15型液氮生物容器(成都金鳳液氮容器有限公司)；LS-B 35L型立式壓力滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設備有限公司)；Eon微孔板分光光度計(美國BioTek公司)；DM3000熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)；DYY-7c型電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)；TL-18M型臺式高速冷凍離心機(上海市離心機械研究所)；PX2型PCR儀(美國Thermo公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 shRNA目標序列的設計與合成:根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小鼠MCHR1 mRNA堿基序列(NM_145132.2)以及shRNA的設計原則，通過RNA干擾設計工具(美國Invitrogen公司)設計特異性插入序列片段。經(jīng)過比對，選出與小鼠MCHR1基因完全一致，并且與小鼠其它基因同源性最低的3條序列；同時再設計一條與MCHR1基因無同源性的陰性對照序列。各目標序列由上海吉凱基因化學技術有限公司合成(見表1)。

表1 小鼠MCHR1干擾目標序列Tab.1 Target sequences of mouse MCHR1

1.2.2 shRNA載體的構(gòu)建及鑒定：將合成的shRNA序列退火后與經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切回收的GV102質(zhì)粒(hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin，6.4kb)在T4 DNA連接酶的作用下16 ℃連接過夜。連接后的產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化實驗，完成構(gòu)建。轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌液PCR鑒定(通用引物法)后將陽性克隆產(chǎn)物進行DNA測序。鑒定正確的重組質(zhì)粒中實驗組分別命名為sh-MCHR1-1、sh-MCHR1-2、sh-MCHR1-3；陰性對照為sh-MCHR1-4。

1.2.3 質(zhì)粒提取及鑒定：37 ℃恒溫搖床搖菌14 h后按試劑盒說明在超凈臺中提取質(zhì)粒。隨后各取2 μL提好的質(zhì)粒，通過微孔板分光光度計測量其A260/A280值。質(zhì)粒純度符合要求后各取5 μL，與1 μL 6×核酸上樣緩沖液混合，進行瓊脂糖凝膠電泳。待指示條帶到膠塊3/4處時，凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍照。

1.2.4 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞。轉(zhuǎn)染前一天，以每孔細胞量約1×104個種植于24孔板，次日匯合約80%時進行轉(zhuǎn)染。細胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine LTX&PLUS說明書操作，轉(zhuǎn)染72h后熒光顯微鏡觀察，Image J軟件通過明場和暗場視野比對計算細胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 RT-PCR檢測MCHR1 mRNA的表達：根據(jù)Trizol說明書分別提取轉(zhuǎn)染各干擾載體的細胞總RNA。隨后各取總RNA 2 μg，5×PrimeScript Buffer 4 μL，補RNase Free水至20 μL混勻；37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。各取cDNA 0.5 μg，Premix TaqTM25 μL，上下游引物(見表2)各1 μL，并補RNase Free水至50 μL混勻；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共循環(huán)30次。加8 μL PCR反應產(chǎn)物進行電泳，拍照，并以β-actin為內(nèi)參。

表2 RT-PCR引物序列Tab.2 Primer sequences for RT-PCR

1.2.6 Western blot檢測MCHR1蛋白的表達：轉(zhuǎn)染72 h后按說明書要求收集各組細胞總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度,隨后取50 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，并電轉(zhuǎn)移至NC膜上。室溫下5%脫脂奶粉搖床上封閉3 h后與1:200稀釋的MCHR1一抗4 ℃孵育過夜。PBST洗膜后與1:7000稀釋的二抗室溫孵育3 h；PBST再次洗膜后加ECL發(fā)光液暗室曝光。BIO-RAD軟件分析蛋白條帶，各蛋白條帶灰度值通過內(nèi)參β-actin校正。

2 結(jié)果

2.1 sh-MCHR1干擾載體菌液PCR，質(zhì)粒鑒定及DNA測序鑒定 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測轉(zhuǎn)化子，以sh-MCHR1-1組為例，連入shRNA的陽性克隆PCR片段大小為367 bp(3、4、5、7號泳道)，未連入的為322 bp(2、6號泳道)。隨后對連入shRNA的陽性克隆產(chǎn)物進行DNA測序鑒定，結(jié)果均與設計合成的序列完全一致，表明各sh-MCHR1載體構(gòu)建成功(見圖1A、1C)。

經(jīng)微量分光光度計測定，各重組質(zhì)粒A260/A280值均介于1.8左右，純度符合要求，適用于細胞轉(zhuǎn)染。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)其目的條帶均介于5000～7500 bp之間，與預測結(jié)果一致，說明提取的質(zhì)粒準確(見圖1B)。

圖1 sh-MCHR1干擾載體鑒定A.sh-MCHR1-1組菌液PCR鑒定 1.雙蒸水組；2.空載體組；M.Maker；3-7.不同轉(zhuǎn)化子組；B.各重組質(zhì)粒凝膠電泳 1.sh-MCHR1-1組；2.sh-MCHR1-2組；3.sh-MCHR1-3組 ；4.sh-MCHR1-4組；C：DNA測序Fig.1 Identification of sh-MCHR1 vector A.Bacterium liquid PCR reaction of sh-MCHR1-1 group。1.ddH2O group; 2.Empty vector group; 3-7.Different transformant groups; B. Gel electrophoresis of every recombinant plasmid。1.sh-MCHR1 group; 2.sh-MCHR1-2 group; 3.sh-MCHR1-3 group; 4.sh-MCHR1-4 group; C.DNA sequencing

2.2 轉(zhuǎn)染細胞及計算轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染72 h后各組熒光強度均達到最佳且基本一致(見圖2)，Image J軟件分析sh-MCHR1-1、sh-MCHR1-2、sh-MCHR1-3、sh-MCHR1-4 4種載體的轉(zhuǎn)染效率分別為(57.37±6.45)%、(58.83±4.39)%、(56.52±11.41)%、(58.15±2.58)%，均適用于基因沉默效果鑒定。

圖2 各組sh-MCHR1載體轉(zhuǎn)染72h效果(×200)Fig.2 Transfection efficacy of every sh-MCHR1 group after 72 hours(×200)

2.3 RT-PCR檢測結(jié)果 與空載體組相比，sh-MCHR1-4組細胞中MCHR1 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義；而sh-MCHR1-1、sh-MCHR1-2、sh-MCHR1-3組細胞中MCHR1 mRNA相對表達量分別為0.13±0.05、0.60±0.13、0.65±0.08，較空載體組表達量均顯著下降(P<0.05)，說明構(gòu)建的各實驗組載體均有效沉默MCHR1基因(見圖3)，且sh-MCHR1-1組效果優(yōu)于另外2組(P<0.01)。

圖3 轉(zhuǎn)染后MCHR1 mRNA的表達水平*P<0.05，**P<0.01，與空載體組相比Fig.3 Level of MCHR1 mRNA expression after transfection*P<0.05，**P<0.01，compared with empty vector group

2.4 Western blot檢測結(jié)果 與空載體組相比，sh-MCHR1-4組細胞中MCHR1蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學意義；而sh-MCHR1-1、sh-MCHR1-2、sh-MCHR1-3組細胞中MCHR1蛋白相對表達量分別為0.15±0.11、0.61±0.07、0.64±0.14，較空載體組表達量均顯著下降(P<0.05)，進一步證實構(gòu)建的實驗組載體有效(見圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)染后MCHR1蛋白的表達水平*P<0.05，**P<0.01，與空載體組相比Fig.4 Level of MCHR1 protein expression after transfection*P<0.05，**P<0.01，compared with empty vector group

3 討論

MCH是一種重要的能量平衡調(diào)節(jié)激素，可通過促進攝食量快速增加而導致肥胖，而缺乏MCH的小鼠相對消瘦[6]。MCHR1是一種G蛋白偶聯(lián)受體，在大鼠、小鼠和人類中高度保守。另外，MCHR1主要在大腦中表達[7]，特別是在海馬、嗅區(qū)以及內(nèi)側(cè)伏隔核內(nèi)，說明了MCHR1參與嗅覺的學習和強化，與攝食調(diào)節(jié)相關。研究認為，缺乏MCHR1基因的動物體質(zhì)量和糖含量下降，活動增多，不易被高脂飲食誘導肥胖[8-9]。除了中樞作用，MCHR1也存在于脂肪、小腸和胰腺等外周組織中，在機體代謝過程中發(fā)揮重要作用[9]。

近年來，RNA干擾技術已成為研究基因功能的重要工具。該技術可以抑制正常生物體特定基因的表達，具有高特異性、高穩(wěn)定性、高效性和可傳播性等特點, 在機體代謝研究領域中應用廣泛[10-12]。為探究MCHR1在外周脂肪組織中的作用，本研究以MCHR1基因為靶點，將體外合成的MCHR1特異性小干擾RNA與含綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒重組成干擾載體sh-MCHR1。經(jīng)菌液PCR與DNA測序鑒定，設計的4組載體均構(gòu)建成功。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠3T3-L1前脂肪細胞后，通過RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)實驗組3種載體均可顯著降低MCHR1 mRNA與蛋白的表達，其中以sh-MCHR1-1最為顯著，有效沉默了MCHR1基因的表達。本研究為進一步利用最佳干擾載體探究脂肪細胞分化信號通路以及動物轉(zhuǎn)染提供了實驗依據(jù)，并為制備預防和治療肥胖癥的基因藥物提供了新思路。

除上述應用外，MCHR1還與甲狀腺功能、抑郁癥、體溫調(diào)節(jié)、睡眠等密切相關[13-15]，若采用sh-MCHR1干擾載體轉(zhuǎn)染相關細胞或動物，對于完善MCHR1基因功能以及探究其生理或病理機制將發(fā)揮積極作用。

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(編校：吳茜)

Construction and identification of shRNA recombinant plasmids targeting MCHR1 gene

ZHAO Zhi-wu1,SHI Lei1,CHEN Xian-jiu2,WHANG Jun-shi1,MA Min1,YAN Jiong1Δ

(1.School of Public Health, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo construct effective small hairpin RNA(shRNA) recombinant plasmids targeting mouse melanin-concentrating hormone receptor 1(MCHR1) gene.Methods Three shRNA sequences targeting mouse MCHR1 gene and one negative control were designed, synthesized and then recombined with plasmid.The shRNA recombinant vectors were detected by bacterium liquid PCR reaction and DNA sequencing.These vectors were also transfected into 3T3-L1 preadipocytes with lipofectamine, and RT-PCR and Western blot analysis were performed to evaluate their silencing effects.ResultsEvery shRNA recombinant vector was constructed and transfected into 3T3-L1 preadipocytes successfully.Compared with empty vector group, three vectors can significantly inhibit the expression of mRNA and protein of MCHR1(P<0.05), and negative control vector had no obvious change.In addition, the effects of the three vectors were different, and the sh-MCHR1-1 produced the best. ConclusionThe shRNA recombinant vectors targeting mouse MCHR1 gene were established successfully, and it will contribute to further study on the relationship between MCHR1 and obesity.

melanin-concentrating hormone receptor 1；RNA interference；shRNA vector；3T3-L1 preadipocytes

趙志武，男，碩士在讀，研究方向：公共衛(wèi)生，E-mail：842294911@qq.com ；燕炯，通信作者，男，副教授，碩士生導師，研究方向：營養(yǎng)相關疾病分子學，E-mail：yanjiong@126.com。

R153

A

1005-1678(2015)02-0014-04