王肖猛,孟祥潮,曹雪松

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252300)

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利用DNA洗牌技術(shù)一次性克隆多個(gè)基因

王肖猛,孟祥潮,曹雪松

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252300)

目的 探討DNA洗牌技術(shù)(DNA shuffling)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等研究的意義。方法 利用DNA洗牌技術(shù)一次性克隆多個(gè)基因片段到表達(dá)載體，并同時(shí)突變基因內(nèi)部的2個(gè)氨基酸位點(diǎn)，PCR、酶切、測序檢測構(gòu)建表達(dá)載體的準(zhǔn)確性。結(jié)果 成功地一次性克隆了3個(gè)編碼小RNA的串聯(lián)短片段MSb1、MSb2、MSb3以及3個(gè)蛋白編碼基因FokI、MS2、FokI，并一次性將PLRV-P0基因內(nèi)部2個(gè)編碼色氨酸(W)的密碼子TGG突變?yōu)榫幋a丙氨酸(A)的GCG密碼子。結(jié)論 DNA洗牌技術(shù)可應(yīng)用于基因組學(xué)、多基因功能鑒定、融合基因表達(dá)和一次性構(gòu)建基因內(nèi)部多個(gè)點(diǎn)突變的研究，具有精確、快速和高效的特點(diǎn)。

DNA洗牌技術(shù)；基因；克隆

隨著人類及越來越多生物的全基因組測序的完成，功能基因組研究需要快速和高通量基因克隆技術(shù)以用于研究代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等，甚至于合成含有多個(gè)基因的新組合生物體系[1-6]。近年來開發(fā)了一些新技術(shù)以用于多片段、高通量DNA的克隆，已得到商業(yè)化推廣的高通量克隆技術(shù)是位點(diǎn)特異性重組克隆系統(tǒng)(site-specific recombinational cloning systems)，包括GATEWAY系統(tǒng)[7-9]和In-fusion系統(tǒng)[10-12]。雖然這些技術(shù)已被廣泛使用，但依然存在以下缺陷：①2種系統(tǒng)都需要將目的基因先通過重組反應(yīng)克隆到入門載體(entry vector，gateway system)或控制載體(master vector，in-fusion system)，再通過一步重組反應(yīng)將基因克隆到目的表達(dá)載體，因此操作步驟繁瑣；②由于需要二步反應(yīng)，加之參與反應(yīng)的酶不止一種，因而費(fèi)用較高；③在目的載體中基因兩側(cè)或一側(cè)會(huì)產(chǎn)生多余的堿基(Gateway技術(shù)在基因兩側(cè)產(chǎn)生25個(gè)，In-fusion技術(shù)在基因上游產(chǎn)生34個(gè)堿基)。當(dāng)需要克隆多個(gè)串聯(lián)基因或在基因的兩端加上標(biāo)簽時(shí)會(huì)產(chǎn)生多余的連接氨基酸(分別為8和11個(gè))；④需要特定的載體系統(tǒng)。所用載體都含有重組反應(yīng)所需的特定序列，因而載體需經(jīng)過改造，并且不能與現(xiàn)有載體實(shí)現(xiàn)共享。

DNA“洗牌術(shù)”又稱DNA改組技術(shù)[13-18]，或DNA體外隨機(jī)拼接技術(shù)，它的原意是指將來源不同但功能相同的一組同源基因，用核酸酶Ⅰ消化成隨機(jī)片段，由這些隨機(jī)片段組成一個(gè)文庫，使之互為引物和模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，當(dāng)一個(gè)基因拷貝片段作為另一基因拷貝的引物時(shí)，引起模板互換，重組因而發(fā)生。DNA洗牌術(shù)為基因克隆和載體構(gòu)建技術(shù)提供了新思路，從而達(dá)到方便、快捷和節(jié)約克隆基因的目的。本文旨在通過PCR，結(jié)合DNA洗牌技術(shù)原理和傳統(tǒng)酶切-連接克隆技術(shù)，分別將3個(gè)基因片段及3個(gè)小片段DNA串聯(lián)克隆入表達(dá)載體。采用一步法定點(diǎn)突變基因內(nèi)部2個(gè)氨基酸位點(diǎn)，以期省略傳統(tǒng)克隆所需的分步酶切-連接的繁瑣步驟，提高多基因(或DNA片段)和產(chǎn)生多位點(diǎn)突變基因的克隆效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株:載體質(zhì)粒pCAMBIA1305和pUC-24MS2以及pGR107來自本實(shí)驗(yàn)室，pST1374購于Addgene公司，大腸桿菌E.coli DH5α菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存，感受態(tài)為本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 工具酶和試劑：質(zhì)粒小量抽提試劑盒和DNA膠回收試劑盒(AXYGEN)購于Promega公司，EcoR Ι等各種限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、卡那霉素、氨芐霉素以及T4 DNA連接酶均購于Takara公司。

1.1.3 合成和測序：引物合成在北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司，測序在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 一次性克隆三個(gè)串聯(lián)短片段DNA：首先用傳統(tǒng)構(gòu)建載體的方法在多克隆位點(diǎn)中插入Polymerase III類的啟動(dòng)子AtU6，可以啟動(dòng)小RNA基因的表達(dá)。該載體命名為p1305-U6，利用該載體中U6啟動(dòng)子下游的Kpn I和Hind III二個(gè)酶切位點(diǎn)，通過DNA 洗牌方法一次性克隆3個(gè)與MS2噬菌體外殼蛋白結(jié)合的小RNA基因片段(MS binding，MSb)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道合成MSb堿基序列，設(shè)計(jì)并合成引物見表1。

表1 合成MS 結(jié)合的PCR引物Tab.1 PCR primers for MS binding gene

將化學(xué)合成的6條寡聚核苷酸鏈(5’端磷酸化修飾)分為MSb1F和MSb1R、MSb2F和MSb2R、MSb3F和MSb3R 3組，每組2條寡聚核苷酸均溶于TE緩沖液,然后每組2條寡聚核苷酸以等摩爾混合，分別經(jīng)高溫變性、退火形成互補(bǔ)雙鏈，其中每兩組之間的3’端和5’端分別含有互補(bǔ)的粘性末端，以形成按順序銜接、相互串聯(lián)的3個(gè)DNA片段。

1.2.2 一次性克隆3個(gè)編碼蛋白基因：通過DNA 洗牌方法一次性克隆3個(gè)長片段串聯(lián)基因，即形成FokI:MS2:FokI。設(shè)計(jì)并合成引物見表2。

表2 FokI和MS2基因的PCR引物Tab.2 PCR primers for FokI and MS2 genes

以pST1374為模板，F(xiàn)okI1F和FokI1R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其兩端分別引入Nco I和Xba I酶切位點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)一步用回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，得到目的片段FokI。以質(zhì)粒pUC-24MS2為模板，WMS2F和WMS2R為引物，采用上步方法獲得目的片段MS2，兩端分別引入限制性酶切位點(diǎn)XbaⅠ和BamHⅠ。同樣方法得到第2個(gè)FokI片段，其兩端引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和BstEⅡ，這樣得到3組雙鏈DNA，用相對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切并膠回收上述3個(gè)PCR片段，每2組之間的3’端和5’端都含有互補(bǔ)的粘性末端，形成按順序銜接、相互串聯(lián)的3個(gè)融合基因。

1.2.3 一次性克隆并突變基因內(nèi)部的2個(gè)氨基酸位點(diǎn)：PLRV-P0 能夠和宿主AGO 1蛋白發(fā)生相互作用，其序列中2個(gè)重復(fù)的WG 基序是其與AGO1蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸。通過DNA 洗牌方法，一次性將PLRV-P0基因序列中第 87 位和第 140 位的編碼色氨酸(W)的密碼子TGG突變?yōu)榫幋a丙氨酸(A)的GCG，并克隆到植物表達(dá)載體pGR107。質(zhì)粒pGR107中含有酶切位點(diǎn)ClaⅠ和SalⅠ，根據(jù)PLRV-P0的基因序列，設(shè)計(jì)合成含有相關(guān)酶切位點(diǎn)的引物，見表3。

表3 突變2個(gè)氨基酸位點(diǎn)的PCR引物Tab.3 PCR primers for two amino acid sites mutation

將合成的6條引物分為P0F和P0WA87R、P0WA87F和P0WA140R、P0WA140F和P0R 3組，分別命名為PW1、PW2、PW3，每組2條引物以等摩爾混合。以pER8(含PLRV的基因組)為模板，分別用3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中PW1 、PW2、PW3的兩端分別引入限制性酶切位點(diǎn)Cla Ⅰ和BspQ Ⅰ、BspQ Ⅰ、BspQ Ⅰ和Sal Ⅰ，經(jīng)相應(yīng)的雙酶切并切膠回收以后3’端和5’端分別含有互補(bǔ)的粘性末端，以形成按順序相互串聯(lián)的3個(gè)DNA片段。

1.3 退火及PCR程序 退火反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30s，60 ℃ 退火30s，72 ℃延伸30s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。 PCR反應(yīng)體系50 μL，含Pfu DNA聚合酶0.1 μL，10×PCR buffer 5 μL(含有Mg2+)，10mmol/L dNTP 1 μL，模板DNA 1 μL(200 μg/的質(zhì)粒)，正反方向引物(稀釋后濃度為10 μM)各2 μL，DNA聚合酶0.1 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s， 30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.4 重組體構(gòu)建方法 用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切載體與目的片段一起等摩爾混合，經(jīng)T4 DNA連接酶在16 ℃下過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，小量提取陽性克隆質(zhì)粒，再進(jìn)行質(zhì)粒PCR、酶切鑒定和DNA測序，測序后與目的基因序列比對(duì)正確者為重組體。

2 結(jié)果

2.1 重組體p1305-U6-3XMSb質(zhì)粒構(gòu)建 EcoR I和Hind III雙酶切鑒定重組體質(zhì)粒，經(jīng)測序可知載體構(gòu)建成功,構(gòu)建示意圖及結(jié)果見圖1。

圖1 重組體p1305-U6-3XMSb構(gòu)建圖A：重組體p1305-U6-3XMSb的構(gòu)建示意圖。藍(lán)、紅、綠色3個(gè)矩形分別代表MSb1、MSb2、MSb3 3個(gè)短基因片段，突出部分為粘性末端，棕色橢圓為載體；B：重組體經(jīng)酶切鑒定的電泳結(jié)果圖。 M.DNA Marker，1.重組質(zhì)粒用EcoR I和Hind III雙酶切得到600bp片段，2.質(zhì)粒p1305-U6雙酶切得到的450bp U6啟動(dòng)子片段；C：3個(gè)串聯(lián)MSb測序峰圖，分別用3個(gè)括號(hào)標(biāo)明Fig.1 Diagram of p1305-U6-3XMSb constructingA.Diagram of constructing p1305-U6-3XMSb, in which the blue, red and green rectangles represent MSb1, MSb2 and MSb3 segments respectively.Highlights is the sticky end.Brown elliptic is the plasmid; B.Agarose gel electrophoresis results of enzyme digestion for p1305-U6-3XMSb, in which M is DNA Marker,1 column is a recombinant plasmid cleaved by EcoRI and HindIII and 600bp segment, 2 column is the fragment of U6 promoter of 450 bp; C.The diagram of DNA sequencing for 3XMSb

2.2 重組體p1305-FokI:MS2:FokI的構(gòu)建 以質(zhì)粒pST1374為模板，PCR擴(kuò)增目的基因FokI和FokI2，以質(zhì)粒pUC-24MS2為模板，WMS2F和WMS2R為引物，擴(kuò)增目的片段MS2。雙酶切鑒定重組子，經(jīng)測序驗(yàn)證載體構(gòu)建成功，構(gòu)建過程及結(jié)果見圖2。

圖2 重組體p1305-FokI:MS2:FokI構(gòu)建圖A：重組體p1305-FokI:MS2:FokI的構(gòu)建示意圖。藍(lán)、紅、綠色3個(gè)矩形分別代表FokI、MS2、FokI 3個(gè)編碼蛋白的基因片段，突出部分為粘性末端，棕色的橢圓代表載體；B、C：FokI和MS2基因的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果圖。M.DNA Marker；1.基因片段，箭頭代表片段大小；D：重組體經(jīng)酶切鑒定的電泳結(jié)果圖。1.重組質(zhì)粒經(jīng)NcoI和BstEII雙酶切得到1700bp的含3個(gè)蛋白基因的片段；E：3個(gè)串聯(lián)蛋白的測序峰圖，分別用大括號(hào)標(biāo)明，因序列太長，中間用省略號(hào)代替Fig.2 Diagram of p1305-FokI:MS2:FokI constructingA:Diagram of constructing p1305:FokI:MS2:FokI, in which the blue, red and green rectangles represent FokI , MS2 and FokI segments respectively who encoded protein.Highlights is the sticky end.Brown elliptic is the plasmid;B,C:Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification for FokI and MS2.M is DNA Marker; 1 is gene fragments, arrows mean the fragment size;D:Agarose gel electrophoresis of enzyme digestion for p1305-FokI-MS2-FokI, 1 is a recombinant plasmid cleaved by NcoI and BstEII and 1700bp segment linked to FokI, MS2 and FokI; E.The diagram of DNA sequencing for FokI, MS2 and FokI, three tandem genes are depicted.Because the sequence is too long, use ellipses instead of in the middle

2.3 重組體pGR107-P0WA的構(gòu)建 以pER8的cDNA為模板，分別以PLRV-P0F和POWA87R、P0WA87F和P0WA140R、P0WA140F和PLRV-P0R、PLRV-P0F和PLRV-P0R為引物，PCR擴(kuò)增得大小約為283 bp、188 bp、370 bp 3個(gè)目的片段。用ClaⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定重組子pGR107-P0WA，得到750 bp目的片段。經(jīng)測序并序列比對(duì)，一次性成功將P0蛋白序列中第87位和第140位的色氨酸(W)點(diǎn)突變?yōu)楸彼?A)，重組體的構(gòu)建示意圖及結(jié)果見圖3。

圖3 重組體pGR107-P0WA構(gòu)建圖A：重組體pGR107-P0WA的構(gòu)建示意圖。黑色橫向箭頭為PCR引物；紅線為PCR片段；橢圓為質(zhì)粒，*為突變氨基酸位點(diǎn)；B：PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果圖。M.DNA Marker；1，2，3.基因片段，箭頭代表片段大??；C：重組體經(jīng)酶切鑒定的電泳結(jié)果圖。M.DNA Markev; 1.重組質(zhì)粒經(jīng)CalI和SalI雙酶切得到的750bp片段；D：突變氨基酸位點(diǎn)的測序峰圖。1，2.PLRV-P0基因未突變前序列及峰圖，1劃橫線的位置是第87位色氨酸(W)，2是140位色氨酸位置；3、4.基因突變后序列及峰圖，劃橫線的位置分別是突變后的第87位和140位丙氨酸(A)。測序序列為反向互補(bǔ)鏈Fig.3 Diagram of pGR107-P0WA constructingA:Diagram of constructing pGR107-P0WA,in which black horizontal arrows represent PCR primers, red lines are PCR fragments, oval represents the plasmid,* is complementary sticky end;B.Agarose gel electrophoresis of PCR amplification, in which M is DNA Marker.1,2,3 are gene fragments, arrows mean the fragment size.C.Agarose gel electrophoresis results of enzyme digestion for pGR107-P0WA, 1 is a recombinant plasmid cleaved by Cal and SalI and 750bp segment; D.The diagram of DNA sequencing for pGR107-P0WA.1,2 are gene sequences of PLRV-P0 without mutation, in which 1 row horizontal position is 87th of tryptophan (W), and 2 is 140 bit position of tryptophan.3,4 are gene sequences with mutation, in which the row horizontal position is 87 and 140 of alanine (A) after mutation

3 討論

后基因組時(shí)代的功能基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)等研究需要克隆、鑒定大量未知基因的功能，近年來發(fā)展起來的合成或整合生物學(xué)研究也需要同時(shí)克隆和表達(dá)一組功能相關(guān)基因，而ZFN和TALEN等基因組編輯技術(shù)也需要串聯(lián)克隆多個(gè)DNA序列結(jié)合蛋白。除了利用重組方法克隆基因外，近年來開發(fā)了幾種多基因組裝技術(shù)，如Golden Gate、BioBricks等，其中Golden Gate技術(shù)是利用Type II類核酸內(nèi)切酶，利用其酶的識(shí)別與切割序列分離的特性，經(jīng)酶切割后可以形成各片段首-尾相互配對(duì)的粘性末端，如載體被改造成含有同一核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，則可經(jīng)同一種酶切割后再連接，該方法對(duì)于串聯(lián)克隆較多DNA片段時(shí)非常有效[19]，但此方法不能兼顧傳統(tǒng)載體上的常用Type II類核酸內(nèi)切酶；BioBricks方法是利用2個(gè)同尾核酸內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)有限片段(一次只能串聯(lián)2個(gè)片段)的連接及克隆[20]。

本文結(jié)合Golden Gate和BioBricks克隆方法的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)兼顧傳統(tǒng)酶切-連接克隆技術(shù)和大部分實(shí)驗(yàn)室已有的克隆載體，利用DNA洗牌技術(shù)，構(gòu)建了一種簡便、高效的多基因克隆方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這是一種簡便、通用、高效的克隆基因的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

① 設(shè)計(jì)操作相對(duì)簡便。傳統(tǒng)方法在構(gòu)建多片段DNA插入的載體時(shí)，每插入一個(gè)片段就需要一次連接、轉(zhuǎn)化及陽性克隆鑒定，操作步驟繁瑣，通常要構(gòu)建多個(gè)中間載體，要經(jīng)多次連接、轉(zhuǎn)化，增加了重組體鑒定時(shí)的工作量，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。本文結(jié)果表明，對(duì)于編碼FokI、MS2、FokI 3個(gè)蛋白基因和MS2 binding RNA小片段DNA，只要引入合適的首尾相連的酶切位點(diǎn)，就可以一次性克隆入目標(biāo)載體，實(shí)現(xiàn)單個(gè)重組反應(yīng)精確連接多個(gè)基因片段，將雙酶切-連接克隆簡化為單個(gè)重組反應(yīng)，便于分子克隆技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)?？寺。挥绊懟虻谋磉_(dá)，大大節(jié)省了時(shí)間，提高了工作效率；② 實(shí)現(xiàn)基因之間的無縫連接。如果用Type II S類核酸內(nèi)切酶，利用其酶的識(shí)別與切割序列分離的特性，經(jīng)酶切割后可以形成各片段首-尾相互配對(duì)的粘性末端，并且不含內(nèi)切酶的識(shí)別序列，則可以實(shí)現(xiàn)基因之間或基因編碼蛋白與標(biāo)簽蛋白之間的無縫連接，即最終克隆的基因無外源冗余氨基酸，所表達(dá)的蛋白質(zhì)可以真實(shí)反應(yīng)其性質(zhì)；③ 可同時(shí)定點(diǎn)突變基因內(nèi)部多個(gè)氨基酸位點(diǎn)。傳統(tǒng)構(gòu)建氨基酸替換突變多用位點(diǎn)重組PCR方法，該方法通過設(shè)計(jì)重疊引物而引入欲突變位點(diǎn)的編碼堿基，并且產(chǎn)生一個(gè)突變位點(diǎn)需經(jīng)二輪PCR，克隆、測序驗(yàn)證后，在此基礎(chǔ)上再經(jīng)同樣過程產(chǎn)生第2個(gè)突變位點(diǎn)，以此類推。過程非常繁瑣且耗費(fèi)時(shí)間。本文利用DNA洗牌術(shù)，通過設(shè)計(jì)含有DNA片段間經(jīng)酶切后的單鏈突出互補(bǔ)末端的引物，在基因片段內(nèi)部一次性引入并克隆2個(gè)氨基酸替換突變，極大地簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。對(duì)于確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸、蛋白質(zhì)分子進(jìn)化等研究提供了一種有效的技術(shù)手段。

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(編校：吳茜)

One step cloning multiple genes using DNA shuffling

WANG Xiao-meng,MENG Xiang-chao,CAO Xue-song

(College of Life science, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China)

ObjectiveTo explore the application of DNA shuffling method in the field of proteomics or metabolomics.MethodsMultiple genes or DNA fragments were cloned into destination vector and mutations of two amino acid substitutions within the gene were obtained though DNA shuffling, and the constructed plasmids were verdified by PCR, enzyme digestion and sequencing methods.ResultsMultiple tandem genes of MSb1, MSb2, MSb3 encoding small RNAs into destination vector were successfully cloned and two TGG encoding tryptophan to GCG encoding alanine within the sequence of PLRV-P0 gene were mutated simultaneously. ConclusionThis approach can be utilized in genomics, multi-gene identification or multi-site mutagenesis and fusion proteins expression, which is precise, cost-effective and high efficacy.

DNA shuffling; gene; clone

國家自然科學(xué)基金(31370387)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2011CM045)

王肖猛，女，碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)，E-mail：973082527@qq.com。

Q81

A

1005-1678(2015)02-0005-05