汪穎，趙賦，張晶，王博，張琪，孫異臨，劉丕楠,*

鹽酸埃克替尼誘導(dǎo)NF2神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞增殖和凋亡研究

汪穎1，趙賦1，張晶1，王博2，張琪1，孫異臨1，劉丕楠1,2*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)外科研究所，北京100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050）

探討鹽酸?？颂婺釋?型神經(jīng)纖維瘤?。∟F2）神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。運用0～80 μmol·L-1鹽酸?？颂婺崽幚鞱F2聽神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞及大鼠神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞系RT4，孵育48 h后通過CCK8比色法檢測藥物對細(xì)胞增殖活力的影響；流式細(xì)胞儀檢測藥物對細(xì)胞凋亡的影響；電子顯微鏡觀察藥物處理后細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)變化；同時應(yīng)用免疫印跡法及實時定量PCR觀察凋亡相關(guān)蛋白表達情況。鹽酸埃克替尼作用后，細(xì)胞增殖活性顯著降低，呈劑量依賴性。流式細(xì)胞儀檢測，10、20、40、80 μmol·L-1鹽酸埃克替尼作用48 h后，凋亡率分別為（6.10± 0.35）%、（10.52±0.87）%、（11.78±0.63）%、（16.05±1.02）%。免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）剪切體增多，實時定量PCR結(jié)果顯示bcl-2基因表達降低，bax基因表達增加。結(jié)果表明，鹽酸?？颂婺崮芡ㄟ^活化Caspase-3及調(diào)控bcl-2、bax基因表達誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞增殖。

鹽酸?？颂婺?；2型神經(jīng)纖維瘤病；神經(jīng)鞘瘤；表皮生長因子受體

2型神經(jīng)纖維瘤病（Neurofibromatosis type 2，NF2）為抑瘤蛋白Merlin缺失導(dǎo)致的全身多發(fā)腫瘤綜合征，外科手術(shù)不能有效抑制全身腫瘤，術(shù)后并發(fā)癥（如聽力喪失，面癱等）較多，可嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。Cole等研究顯示Merlin可負(fù)向調(diào)控表皮生長因子受體（EGFR）通路，提示EGFR或為NF2腫瘤潛在治療靶點[3]。研究者嘗試將EGFR抑制劑用于NF2患者治療并取得初步療效[4]，但此類藥物價格昂貴。鹽酸?？颂婺釣槲覈灾餮邪l(fā)的一種靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI），現(xiàn)已用于晚期非小細(xì)胞肺癌的治療[5-6]，但對NF2腫瘤治療效果不詳。因此，本研究首先在細(xì)胞水平上檢測鹽酸埃克替尼對NF2神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞毒性作用并探討其可能機制，以評估其應(yīng)用于NF2腫瘤臨床治療的可能價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科2013年9月～2014年12月NF2患者聽神經(jīng)鞘瘤新鮮手術(shù)標(biāo)本5例進行原代細(xì)胞培養(yǎng)[7]，所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理確診。

1.2 主要儀器及試劑

大鼠神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞系RT4購自ATCC；胎牛血清（FBS）（購自美國Gibico公司）；DMEM培養(yǎng)液（購自美國Gibico公司）；CCK8試劑盒（購自日本同仁）；細(xì)胞周期檢測試劑盒（購自四正柏公司）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（購自四正柏公司）；蛋白裂解液（RIPA）（購自北京普利來基因技術(shù)公司）；蛋白定量檢測試劑盒（購自北京普利來基因技術(shù)公司）；Caspase-3剪切體抗體購自abcam，β肌動蛋白抗體（β-actin）購自北京普利來基因技術(shù)公司；鹽酸?？颂婺嵊烧憬愡_藥業(yè)惠贈。

1.3 方法

1.3.1 EGFR基因突變檢測

從凍存的NF2聽神經(jīng)瘤標(biāo)本中提取DNA，PCR擴增35個循環(huán)，退火溫度60℃。反應(yīng)所需引物序列如下：第19號外顯子上游引物5'GTG CATCGCTGGTAACATCCAC 3'，下游引物5'CAGA GCAGCTGCCAGACATGAG 3'，擴增19號外顯子247 bp；第20號外顯子上游引物5'CCATGAGTAC GTATTTTGAAACTC 3'，下游引物5'TTATCTCCC CTCCCCGTATC 3'，擴增20號外顯子317 bp；擴增第21號外顯子上游引物5'CTGAATTCGGATG CAGAGCTTC 3'，下游引物5'GAGAGCATCCTC CCCTGCATGTG 3'，擴增21號外顯子307 bp；引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成及測序，結(jié)果與基因庫EGFR基因序列進行比對。

1.3.2 CCK8法評價鹽酸?？颂婺釋ι窠?jīng)鞘瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔板中，100 μL·孔-1，每孔細(xì)胞數(shù)1 500個。含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后棄上清，每組3個復(fù)孔。分別設(shè)置空白組及不同濃度給藥組：10、20、40和80 μmol·L-1。給藥后37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入100 μL含10%CCK8混合液，37℃孵育2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定吸光度值。

1.3.3 Ca2+依賴性脂結(jié)合蛋白（Annexin V）/碘化丙啶（PI）法檢測鹽酸?？颂婺釋?xì)胞凋亡的作用

取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別將細(xì)胞接種于96孔板中，2×105個細(xì)胞·孔-1。含10%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集每孔細(xì)胞，分別加入10 μL PI和5 μL Annexin V，室溫避光反應(yīng)15 min后，流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞比例。

1.3.4 電鏡觀察鹽酸?？颂婺嶙饔煤蠹?xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

細(xì)胞經(jīng)戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，50%、70%乙醇逐級脫水，80%、90%、100%丙酮逐級脫水，100%丙酮∶環(huán)氧樹脂Epon812包埋機以1∶1混合置換，環(huán)氧樹脂Epon812包埋劑37℃浸透過液。將組織置包埋膜內(nèi)Epon812包埋劑包埋。在解剖顯微鏡下修塊，切片，HE染色，定位，切片，撈片。70%乙醇配制的飽和醋酸鈾染色，鉛染液染色。干燥后電鏡觀察。

1.3.5 蛋白免疫印跡法檢測鹽酸?？颂婺釋Φ蛲鐾返挠绊?/p>

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×105個細(xì)胞·孔-1接種于六孔板中培養(yǎng)24 h，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用蛋白裂解液（RIPA）分別提取細(xì)胞總蛋白。分別檢測Caspase-3剪切體、β-actin蛋白表達。Western印跡試驗結(jié)果應(yīng)用美國Bio-Rad公司Quantity One軟件進行掃描分析。

1.3.6 RT-PCR檢測鹽酸埃克替尼對bcl-2、bax基因表達影響

收獲不同濃度鹽酸埃克替尼作用后的細(xì)胞采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，oligo（dT）15將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，PCR擴增細(xì)胞mRNA中的bcl-2、bax、gapdh基因，所用引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成（見表1）。PCR反應(yīng)按照Realtime PCR試劑盒SYBR Premix Dimer EraserTM說明書進行。總體積20 μL，SYBR Premix Dimer EraseTM（2×）10 μL，PCR Forword Primer（10 μmol·L-1）0.6 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol·L-1）0.6 μL，Template（＜500 ng）2 μL，ddH2O（滅菌蒸餾水）6.4 μL。擴增條件：95℃，30 s；95℃，5 s；55℃，20 s；72℃，15 s；共40個循環(huán)。

表1 RT-PCR引物序列Table1Primers list of RT-PCR

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad prism 5.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，計量資料以X±S表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P≤0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NF2聽神經(jīng)鞘瘤EGFR突變類型檢測

在檢測的13例NF2聽神經(jīng)瘤標(biāo)本中，測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進行比對，結(jié)果未在EGFR常見突變的19、20或21號外顯子中發(fā)現(xiàn)有基因突變。

2.2 鹽酸埃克替尼對神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

經(jīng)鹽酸?？颂婺嶙饔?8 h后，與未加藥對照組相比，原代NF2聽神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞、大鼠神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞系RT4生長均受到明顯抑制，且呈劑量依賴性（見圖1）。

圖1 鹽酸?？颂婺嵋詣┝恳蕾嚪绞揭种粕窠?jīng)鞘瘤細(xì)胞增殖Fig.1Icotinib inhibits the proliferation of schwannoma cells in a dose dependent manner

2.3 鹽酸?？颂婺嵴T導(dǎo)神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞的凋亡

細(xì)胞胞漿膜不對稱性喪失導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸（PS）外翻是細(xì)胞凋亡的早期過程，Annexin V可與PS特異性結(jié)合，用于早期細(xì)胞凋亡檢測。對藥物作用后的RT4細(xì)胞進行Annexin V-FITC，PI雙標(biāo)檢測顯示，與未加藥組相比，鹽酸?？颂婺嶙饔煤?，細(xì)胞凋亡比例明顯增高，鹽酸?？颂婺嶙饔?8 h后，0、10、20、40、80 μmol·L-1各劑量組細(xì)胞凋亡率分別為：4.52%±0.32%、6.10%±0.35%、10.52%±0.87%、11.78%±0.63%、16.05%±1.02%。結(jié)果顯示，鹽酸埃克替尼可誘導(dǎo)神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴關(guān)系，即隨劑量增加，其發(fā)生凋亡細(xì)胞率也逐漸增高（見圖2）。

2.4 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)

未經(jīng)鹽酸?？颂婺崽幚淼腞T4細(xì)胞在透射電子顯微鏡下觀察可見細(xì)胞包膜完整，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核圓且居中，核仁明顯。核內(nèi)染色體分布均勻，常染色質(zhì)豐富，沿細(xì)胞核膜分布。而經(jīng)80 μmol·L-1鹽酸?？颂婺嶙饔?8 h后，細(xì)胞則呈現(xiàn)細(xì)胞核皺縮且形狀不規(guī)則，并出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、邊聚，核碎裂及凋亡小體（見圖3）。

圖2 鹽酸?？颂婺嵴T導(dǎo)神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞凋亡Fig.2Icotinib increases apoptosis of schwannoma cells

圖3 鹽酸埃克替尼誘導(dǎo)神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞形成凋亡小體Fig.3Transmission electron microscopy(TEM)shows apoptosis body in the schwannoma cells treated with icotinib

2.5 鹽酸?？颂婺嵬ㄟ^活化Caspase-3及調(diào)控bcl-2,bax基因表達水平誘導(dǎo)凋亡

80 μmol·L-1鹽酸?？颂婺崽幚鞷T4細(xì)胞48 h后，提取其總蛋白，Western-blot檢測Caspase-3剪切體表達，由圖4A中可知，鹽酸埃克替尼可上調(diào)Caspase-3剪切體表達，且隨濃度增加作用增強。RT-PCR檢測bcl-2、bax基因表達結(jié)果顯示（見圖4B），鹽酸?？颂婺嶙饔煤罂烧T導(dǎo)bcl-2表達下調(diào)，bax表達上調(diào)。

圖4 鹽酸?？颂婺嵬ㄟ^誘導(dǎo)Caspase-3活化及調(diào)控bcl-2，bax基因表達水平誘導(dǎo)凋亡Fig.4Icotinib increases apoptosis of schwannoma cells associated with an increased expression of cleaved-Caspase-3 and altered expression of bcl-2，bax genes

3 討論與結(jié)論

2型神經(jīng)纖維瘤病為NF2基因突變導(dǎo)致其編碼抑瘤蛋白Merlin功能缺失而致的常染色體顯性遺傳疾病，長期持續(xù)病變嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量及壽命。目前該病治療總體仍以傳統(tǒng)手術(shù)切除為主，而不能阻止腫瘤新生，因此患者終生受病痛折磨并面臨不斷手術(shù)的困境[8]。Curto等研究顯示，Merlin可抑制活化的EGFR分子內(nèi)化、再循環(huán)及新的EGFR亞基運輸?shù)郊?xì)胞表面，從而調(diào)控細(xì)胞增殖[9-10]。在Merlin缺失的神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞表面也檢測到有EGFR高表達[11]。學(xué)者開始嘗試使用EGFR抑制劑用于NF2臨床治療，但效果不一。彭濤等研究認(rèn)為，鹽酸埃克替尼為一口服的小分子EGFR-TKI，主要通過競爭EGFR胞內(nèi)區(qū)酪氨酸的ATP結(jié)合位點，進而抑制EGFR自發(fā)磷酸化作用，阻斷下游信號通路活化[12]。該藥可選擇性抑制EGFR野生型及突變體（L858R，L861Q），對其他激酶無明顯抑制作用[13]，故本研究首先對13例NF2聽神經(jīng)鞘瘤標(biāo)本EGFR的19、20、21號外顯子進行測序，未發(fā)現(xiàn)有突變發(fā)生，為野生型，屬該藥作用范疇。試驗結(jié)果也證實鹽酸?？颂婺峥梢种芅F2聽神經(jīng)鞘瘤原代細(xì)胞及RT4細(xì)胞系增殖，且隨藥物作用濃度提高，抑制作用增強，呈劑量依賴性。但作用濃度過大時（160 μmol·L-1），細(xì)胞增殖完全抑制，毒性作用明顯；作用濃度過低時，無抑制作用（5 μmol·L-1）（陰性結(jié)果，未提供）。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析藥物作用后對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果證實鹽酸?？颂婺嶙饔煤笈c空白對照組相比，早期凋亡比例和晚期凋亡比例均顯著增加，說明鹽酸?？颂婺釋ι窠?jīng)鞘瘤細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過啟動細(xì)胞凋亡實現(xiàn)。而透射電子顯微鏡觀察結(jié)果也顯示鹽酸?？颂婺嶙饔脮龠M凋亡小體形成。

凋亡發(fā)生是由Caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程[14]，Caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分[15]，在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)核心地位，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”[16]。本研究表明，經(jīng)鹽酸?？颂婺嶙饔煤?，神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞Caspase-3明顯激活。而Bcl-2家族的表達和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的另一關(guān)鍵因素[17]，研究表明，Caspase-3能裂解Bcl-2蛋白，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。本試驗中也發(fā)現(xiàn)經(jīng)鹽酸?？颂婺嶙饔煤螅琤cl-2基因表達下調(diào)，bax基因表達上調(diào)。以上結(jié)果表明，鹽酸?？颂婺峥赏ㄟ^啟動Caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑及通過調(diào)控bcl-2，bax基因表達利于Caspase激活從而實現(xiàn)對細(xì)胞增殖的抑制。

本研究結(jié)果表明，鹽酸?？颂婺峥擅黠@抑制NF2聽神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機制與誘導(dǎo)Caspase-3活化及調(diào)控bcl-2，bax基因表達水平相關(guān)，為新型酪氨酸激酶抑制劑應(yīng)用于NF2臨床治療提供理論依據(jù)。

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Study on icotinib of the proliferation and apoptosis of neurofibromato?sis type 2 related schwannoma cells/

WANG Ying1,ZHAO Fu1,ZHANG Jing1,WANG Bo2,ZHANG Qi1,SUN Yilin1,LIU Pinan1,2(1.Beijing Neurosurgical Institute,Capital Medical University, Beijing 100050,China;2.Beijing Tiantan Hospital,Affiliated of Capital Medical University,Beijing 100050,China)

To explore the role of icotinib on the proliferation and apoptosis of neurofibromatosis type 2 (NF2)related schwannoma cells.Primary cultured NF2 related human schwannoma cells and rat schwannoma cell line RT4 cells were treatedin vitrowith icotinib at a concentration gradient of 0-80μmol·L-1, and its role on the cell proliferation and apoptosis were analyzed by the CCK8 assay and flow cytometer, respectively.The ultrastructural changes was evaluated by electron microscopy,and apoptosis-related proteins and genes were detected using Western-blot and RT-PCR.Results showed that icotinib inhibites the proliferation of primary NF2-related schwannoma cells and RT4 cells in a dose dependent manner,after treatment with 10,20,40 and 80μmol·L-1icotinib for 48 h,the rates of cell apoptosis were(6.10±0.35)%,(10.52±0.87)%,(11.78±0.63)%and(16.05±1.02)%,respectively.These effects were associated with an increased expression of cleaved-Caspase-3 and altered expression ofbcl-2,baxgenes.Thus,icotinib may plays a role in inhibiting proliferation,and increasing apoptosis of schwannoma cells.

icotinib;neurofibromatosis type 2;schwannoma;EGFR

R739.4

A

1005-9369（2015）07-0057-05

時間2015-7-9 14:42:45[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150709.1442.011.html

汪穎,趙賦,張晶,等.鹽酸?？颂婺嵴T導(dǎo)NF2神經(jīng)鞘瘤細(xì)胞增殖和凋亡研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,46(7)∶57-61.

Wang Ying,Zhao Fu,Zhang Jing,et al.Study on icotinib of the proliferation and apoptosis of neurofibromatosis type 2 related schwannoma cells[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(7)∶57-61.(in Chinese with English abstract)

2015-01-15

國家自然科學(xué)基金項目（81372715）

汪穎（1986-），女，博士，研究方向為腫瘤免疫及生物治療。E-mail:wangying_cams@163.com

*通訊作者：劉丕楠，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為顱腦腫瘤。E-mail:liupinan@gmail.com