王翠梅，董然然，王一蘭，袁 濤，陳瑞丹

（花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京100083）

梅（Prunus mume）是中國(guó)傳統(tǒng)名花，同時(shí)也是中國(guó)第一種獲得國(guó)際品種登錄權(quán)的花卉，距今已有7 000多年的應(yīng)用史和3 000多年的栽培史［1］。梅自古就以寒中開(kāi)放的特性受到中國(guó)人民的喜愛(ài)，但梅花的抗寒能力并沒(méi)有人們想象的那么強(qiáng)。梅的露地栽植范圍大致以黃河為北界，以珠江為南界［2］，因此中國(guó)北方人民無(wú)緣欣賞到梅花。中國(guó)梅花工作者自20世紀(jì)中期開(kāi)始培育抗寒梅花品種，通過(guò)引種馴化、實(shí)生選種的方式株選出‘北京玉蝶’（P．mume‘Bei jingYudie’）和‘北京 小’梅（P．mume‘Beijing Xiaomei’）等真梅系抗寒梅花品種［3］，可以在北京露地越冬。20世紀(jì)80年代開(kāi)始的遠(yuǎn)緣雜交育種育成了‘燕杏’梅（P．mume‘Yanxing’）、‘花蝴蝶’（P．mume‘Hua Hudie’）、‘山桃白’（P．mume‘Shantaobai’）梅等杏梅系品種［4－5］，并成功引種‘淡豐后’（P．mume‘Dan Fenghou’）等13 個(gè)品種。陳瑞丹以培育芳香抗寒梅花品種為目標(biāo)，通過(guò)雜交育種成功培育出芳香抗寒的梅花新品種‘香瑞白’梅（P．mume‘Xiang Ruibai’）［6］。但 這 些 品 種 雖 抗 寒 性強(qiáng)，但開(kāi)花較晚，在北京及以北地區(qū)自然花期在3月下旬至4月初，不能體現(xiàn)梅早花的特性，降低了其觀賞性。因此，如何提早抗寒梅花的花期是目前育種工作者迫切需要解決的問(wèn)題。

種間遠(yuǎn)緣雜交是植物種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良的重要途徑之一［7］，遠(yuǎn)緣雜交后代有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交獲得抗逆性強(qiáng)、觀賞價(jià)值高的植物新品種是育種家追求的目標(biāo)，‘燕杏’梅、‘花蝴蝶’梅、‘山桃白’梅等都是通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交獲得的，抗寒性極強(qiáng)。但不同物種間存在一定的生殖隔離，遠(yuǎn)緣雜交常表現(xiàn)為雜交不親和性和雜種不育性，難以獲得雜種后代［8］。為提早抗寒梅花的花期，使北國(guó)人民也能感受到梅花的韻味，本研究開(kāi)展了梅與山桃、‘白花’山桃的雜交育種工作。選擇自然結(jié)實(shí)率高且抗寒（能在北京地區(qū)露地栽植）的真梅品種‘江梅’、杏梅品種‘淡豐后’為母本。山桃（P．davidiana）和‘白花’山桃（P．davidiana‘Alba’）抗寒性強(qiáng)，是北京地區(qū)花期最早的梅花同屬植物，且前人已獲得山桃和‘小綠萼’梅（P．mume‘Xiao Lv，e’）的雜交種‘山桃白’梅［5］，因此選擇山桃和‘白花’山桃作為本試驗(yàn)的父本。對(duì)雜交結(jié)實(shí)率、授粉后花粉在柱頭的萌發(fā)以及花粉管的生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行觀察，探討各雜交組合的親和性，并對(duì)未成熟胚進(jìn)行培養(yǎng)，為梅花的遠(yuǎn)緣雜交育種工作提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 試驗(yàn)材料

雜交試驗(yàn)于2014年3月下旬至4月上旬在青島梅園進(jìn)行，熒光觀察和胚培養(yǎng)試驗(yàn)在北京林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。雜交母本樹(shù)為青島梅園生長(zhǎng)健壯的‘江梅’、‘淡豐后’梅，父本為北京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)多年生且生長(zhǎng)健壯的山桃和‘白花’山桃，雜交組合為‘江梅’×山桃、‘江梅’ב白花山’桃，‘淡豐后’×山桃、‘淡豐后’ב白花’山桃。授粉在3月底～4月上旬，上午9：30～11：00，天氣晴好，無(wú)風(fēng)或微風(fēng)，溫度10 ℃～20 ℃。

1．2 授粉方法

1．2．1 花粉的采集和貯藏 3月初山桃、‘白花’山桃開(kāi)花前，采集氣球期花蕾，在室內(nèi)通風(fēng)條件下自然陰干散粉后，收集花粉置于裝有變色硅膠的干燥管中，－20 ℃條件下冰凍保存。

1．2．2 花粉生活力的測(cè)定 授粉前采用懸滴培養(yǎng)法測(cè)定花粉的活力。培養(yǎng)基為5%蔗糖＋10μg／mL硼酸，24 ℃下培養(yǎng)6h。測(cè)得山桃花粉發(fā)芽率為55%、‘白花’山桃為60%，均可用于授粉。

1．2．3 雜交授粉方法 3月底～4月上旬梅花初開(kāi)時(shí)，先對(duì)大蕾期母本用連被去雄法去雄，即用大拇指和食指將萼片、花瓣和雄蕊一次性撕掉的去雄方法，同時(shí)授以父本花粉并套袋掛牌，每朵花重復(fù)授粉2次。

1．3 花粉管生長(zhǎng)行為觀察

授粉后4、8、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h取樣，每組合隨機(jī)選取授粉后的花柱20 個(gè)，用FAA 固定液（甲醛∶冰醋酸∶70%酒精＝1∶1∶18，V／V）固定24h以上，4 ℃冰箱保存。

花粉在柱頭上萌發(fā)和花粉管行為觀察：經(jīng)FAA固定液固定的雌蕊，先用蒸餾水沖洗3次，然后放入8mol／L NaOH 溶液中軟化4h，蒸餾水沖洗干凈后，放入含0．1mol／L K3PO4的0．1%的水溶性苯胺藍(lán)溶液中染色1h。然后將花柱放于載玻片上，蓋玻片輕輕壓平。在Olympus熒光顯微鏡下觀察記錄花粉管生長(zhǎng)情況。

1．4 雜交結(jié)實(shí)率比較及雜種幼胚拯救

授粉1 周后，拆除套袋，用紗網(wǎng)裹住授粉的大枝，防止果實(shí)掉落。之后每隔15d 統(tǒng)計(jì)1 次座果率，直至果實(shí)成熟。

2014年6月采收授粉后60d左右的果實(shí)，將梅果肉洗凈，砸開(kāi)種核，取出種仁，置于流水下沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)上將種仁先后用70%酒精和1%次氯酸鈉溶液消毒30s和25min，每次消毒后均用無(wú)菌水沖洗3～5次，去除內(nèi)種皮，取帶1／4子葉的幼胚 接 種 于①2／3WPM ＋0．5 mg／L IBA＋2．0 mg／L 6－BA＋0．5g／L 活性炭＋40g／L 蔗糖＋7 g／L瓊脂和②WPM＋0．5mg／L IBA＋2．0mg／L 6－BA＋0．5g／L 活性炭＋40g／L 蔗糖＋7g／L 瓊脂，pH 5．8～6．0的培養(yǎng)基中，置于2 ℃～4 ℃的冰箱中低溫黑暗處理90d，然后轉(zhuǎn)入光照組培室［溫度（23＋2）℃，濕度60%左右，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照14h／d］中培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)情況適時(shí)打開(kāi)煉苗，煉苗后移栽至花盆中（7cm×7cm），移栽基質(zhì)為珍珠巖∶進(jìn)口泥炭土∶河沙＝1∶1∶1（V／V），基質(zhì)使用前用高溫滅菌鍋120 ℃滅菌2h。移栽后置于人工氣候箱（白天25℃，晚上20℃，光照16h／d，濕度60%，光照80%）培養(yǎng)，觀察記錄雜交種子萌發(fā)情況。

結(jié)實(shí)率＝（獲得果實(shí)數(shù)／授粉花數(shù)）×100%

幼胚萌發(fā)率＝（萌發(fā)的胚數(shù)／接種數(shù)）×100%

敗育率＝（敗育的胚數(shù)／接種數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2．1 梅與山桃、‘白花’山桃種間雜交結(jié)實(shí)性

由表1可以看出，各雜交組合結(jié)實(shí)率都很低，在‘江梅’ב白花’山桃的雜交組合中，未能獲得雜交果實(shí)，表現(xiàn)為種間遠(yuǎn)緣雜交不親和性。‘江梅’和山桃雜交結(jié)實(shí)率只有0．7%，雜交親和性很低。結(jié)實(shí)率較高的是以‘淡豐后’為母本的兩個(gè)組合，分別為3．1%和7．4%。授粉后35d左右出現(xiàn)嚴(yán)重的落果現(xiàn)象，落果率高達(dá)90%，落果現(xiàn)象可能是由胚發(fā)育不正常造成的，且收獲的果實(shí)大多不飽滿，這種未成熟的果實(shí)即使沙藏后播種，也不能萌發(fā)。作者于2013年1月播種沙藏后的雜交種子，均未萌發(fā)，砸開(kāi)種核發(fā)現(xiàn)里面的種仁已腐爛。分析原因認(rèn)為，梅果實(shí)發(fā)育快、時(shí)間短，果實(shí)達(dá)到成熟時(shí)，胚還尚未成熟，尤其是遠(yuǎn)緣雜交由于親和力的關(guān)系，胚后期發(fā)育不良，萌芽力很低。因此，雜交種子采取播種的方法在本試驗(yàn)中不能使用，必須采用更有效的試驗(yàn)方法進(jìn)行胚拯救。

2．2 梅與山桃、‘白花’山桃授粉后花粉管行為觀察

授粉后，山桃和‘白花’山桃的花粉粒在梅柱頭上4～8h均能萌發(fā)，但花粉粒的萌發(fā)情況和花粉管的生長(zhǎng)有很大差異?！贰辽教?，4h 后觀察到少量山桃花粉粒能夠在‘江梅’柱頭萌發(fā)，8h 后萌發(fā)量增加（圖版Ⅰ，1），但12h后即觀察到柱頭乳突細(xì)胞出現(xiàn)胼胝質(zhì)塞（圖版Ⅰ，2），48h 后停止生長(zhǎng)，花粉管頂端膨大、彎曲，未能進(jìn)入子房（圖版Ⅰ，3），不能完成授精作用；‘江梅’ב白花’山桃，‘白花’山桃的花粉粒在‘江梅’柱頭上8h后僅有少量萌發(fā)，且伴隨有大量的胼胝質(zhì)沉積，花粉管末端發(fā)生彎曲、斷裂、纏繞（圖版Ⅰ，4），未能正常生長(zhǎng)；‘淡豐后’×山桃，4h后即能大量萌發(fā)（圖版Ⅰ，5），8h后觀察到花粉管已開(kāi)始深入花柱，48h 后到達(dá)花柱中部，但此后花粉管不再伸長(zhǎng)（圖版Ⅰ，6），未能進(jìn)入子房；‘淡豐后’ב白花’山桃，4h后觀察到花粉粒開(kāi)始萌發(fā)（圖版Ⅰ，7），12h 大量萌發(fā)，在花柱中延伸生長(zhǎng)（圖版Ⅰ，8），96h后觀察到花粉管進(jìn)入子房（圖版Ⅰ，9）。

以‘江梅’為母本的兩個(gè)雜交組合，雖然花粉粒能在梅柱頭萌發(fā)，但均未觀察到花粉管進(jìn)入到子房，不能完成授精作用，存在授精前障礙；在以‘淡豐后’為母本的組合中，‘白花’山桃的花粉粒能夠在雌蕊柱頭萌發(fā)，沿花柱延伸，最后進(jìn)入子房，完成授精作用，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率低的原因是在果實(shí)發(fā)育中，胚敗育導(dǎo)致大量落果。

2．3 幼胚培養(yǎng)萌發(fā)情況

由于2013年播種雜交種子均未萌發(fā)，因此本次試驗(yàn)種子處理采用胚培養(yǎng)的方法獲得雜種苗。如表2中所示，接種數(shù)和結(jié)實(shí)數(shù)不一致的原因是雜交親和性低、雜種存在嚴(yán)重?cái)∮那闆r，并不是所有果實(shí)里都有飽滿的胚，有的是干癟的胚，有的是水漬狀非正常的胚。遠(yuǎn)緣雜交極低的結(jié)實(shí)率以及胚敗育導(dǎo)致最后能接種的幼胚極少。

表1 梅與山桃、‘白花’山桃種間雜交結(jié)實(shí)性比較Table 1 Fertility of interspecific crosses between P．mume and P．davidianaor P．davidiana‘Alba’

表2 梅與山桃 白花 山桃雜交幼胚培養(yǎng)萌發(fā)情況Table 2 Germination of immature embryo between P．mume and P．davidianaor P．davidiana‘Alba’

放置2 ℃～4 ℃的冰箱低溫培養(yǎng)，每周觀察一次萌發(fā)情況。低溫培養(yǎng)50～55d后，雜種B、C胚開(kāi)始萌動(dòng)，幼芽呈現(xiàn)淡黃綠色，這與黑暗培養(yǎng)有關(guān)，未能進(jìn)行光合作用，70d后胚根伸長(zhǎng)約1cm。低溫90 d后轉(zhuǎn)入光照組培室培養(yǎng)，1～2d后，幼葉開(kāi)始轉(zhuǎn)綠、伸展，根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)（圖版Ⅰ，10、11）。5d后已長(zhǎng)出數(shù)條二級(jí)根，此時(shí)打開(kāi)三角瓶上的封口膜，煉苗5 d后移栽入盆，置于人工氣候箱中生長(zhǎng)，每天觀察生長(zhǎng)情況，視具體情況定時(shí)澆水。移栽2周后，雜種苗苗高達(dá)5～8cm（圖版Ⅰ，12、13），雜種B 從葉形上已完全表現(xiàn)出父本的特性（圖版Ⅰ，12），可以初步鑒定為‘淡豐后’和山桃的雜交后代。在人工氣候箱中培養(yǎng)5～6月后，待植株生長(zhǎng)健壯，且天氣轉(zhuǎn)暖后，換大盆移栽至露地生長(zhǎng)。

通過(guò)未成熟胚培養(yǎng)獲得了梅與山桃的雜種苗，說(shuō)明胚培養(yǎng)是獲得種間雜種苗的有效途徑。

3 討 論

種間遠(yuǎn)緣雜交是培育新品種的重要途徑之一，但是種間雜交存在不親和性以及雜種不育是遠(yuǎn)緣雜交育種中的兩大障礙。

張啟翔［9］曾觀察了山桃花粉粒在‘小綠萼’梅、‘大羽’梅等真梅品種柱頭上的萌發(fā)，發(fā)現(xiàn)山桃花粉和梅柱頭之間不存在不親和反應(yīng)，都能在柱頭表面萌發(fā)。本研究也觀察到類(lèi)似的現(xiàn)象，本試驗(yàn)4個(gè)雜交組合，花粉粒均能在雌蕊柱頭上萌發(fā)，說(shuō)明梅和山桃種間雜交柱頭表面不存在不親和反應(yīng)，除了‘淡豐后’ב白花’山桃組合觀察到花粉管進(jìn)入子房，其他組合都未觀察到花粉管進(jìn)入子房，分析最后未能完成授精的原因，可能是和花柱中的某些物質(zhì)發(fā)生識(shí)別障礙。Knox［10］通過(guò)研究楊屬種間雜交提出了主動(dòng)識(shí)別的概念，認(rèn)為柱頭識(shí)別出不親和的花粉壁蛋白后在乳突細(xì)胞內(nèi)迅速產(chǎn)生胼胝質(zhì)，阻止花粉管繼續(xù)生長(zhǎng)進(jìn)入子房。本試驗(yàn)通過(guò)熒光觀察，發(fā)現(xiàn)山桃和‘白花’山桃的花粉授于‘江梅’柱頭后，花粉管生長(zhǎng)緩慢，均在花柱中產(chǎn)生大量胼胝質(zhì)。分析原因可能是花粉粒與雌蕊柱頭識(shí)別過(guò)程中，柱頭存在抑制物質(zhì)，阻礙花粉管的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生胼胝質(zhì)［11］，這是生物物種為了維持種間生殖隔離達(dá)到保存種性的目的［12］。不同雜交組合其結(jié)實(shí)率也存在差異，‘江梅’與‘白花’山桃雜交結(jié)果率為0，通過(guò)花粉管生長(zhǎng)行為的觀察，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在授精前障礙。結(jié)實(shí)率較高的為‘淡豐后’和山桃、‘白花’山桃之間的雜交，且不同親本對(duì)雜種胚的萌發(fā)率也有影響。梁青等通過(guò)研究甜櫻桃和中國(guó)櫻桃的遠(yuǎn)緣雜交發(fā)現(xiàn)不同親本對(duì)雜交座果率和雜種胚的萌發(fā)生長(zhǎng)率均有顯著影響［13］，這可能是由遺傳背景不同造成的。

遠(yuǎn)緣雜交獲得的果實(shí)由于親和力差的原因，胚后期發(fā)育不良，即使通過(guò)沙藏后播種也未萌發(fā)，砸開(kāi)種核發(fā)現(xiàn)種仁已腐爛。本試驗(yàn)獲得雜交果95個(gè)，種仁不飽滿或干癟率為47．4%，因此很難用常規(guī)播種方法獲得雜種苗。胚培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展有效地解決了這個(gè)問(wèn)題［14］，通過(guò)胚拯救已獲得杏和桃、李等的雜種苗［15－16］。本試驗(yàn)也有力地證明了胚培養(yǎng)技術(shù)在遠(yuǎn)緣雜交育種中的重要作用，通過(guò)胚培養(yǎng)共獲得雜種苗13株，表明幼胚拯救是獲得種間雜種苗、提高雜交成功率的重要途徑。

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Explanation of plate：

PlateⅠ Fig．1－9．Pollen germination and pollen tube growth in different cross combinations between P．mume and P．davidiana：Fig．1．P．mume‘Jiangmei’×P．davidiana，pollen germinated 4hafter pollination，×200；Fig．2．P．mume‘Jiangmei’×P．davidiana，callose accumulated 8hafter pollination，×100；Fig．3．P．mume‘Jiangmei’×P．davidiana，the end of pollen tube bended and swelled，×100；Fig．4．P．mume‘Jiangmei’×P．davidiana‘Alba’，pollen tube bended，twined and fractured 48hafter pollination，×100；Fig．5．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana，a lot of pollen germinated on the stigma，×100；Fig．6．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana，pollen tube arrived at the middle of style 48hafter pollination，×100；Fig．7．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana‘Alba’，pollen germinated 4hafter pollination，×200；Fig．8．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana‘Alba’，pollen tube prolongated in the style 12hafter pollination，×100；Fig．9．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana‘Alba’，pollen tube stretched into the ovary 96hafter pollination，×400．Fig．10－13．Embryo culture and hybrid：Fig．10．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana‘Alba’；Fig．11．P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana；Fig．12．Hybrid of P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana；Fig．13．Hybrid of P．mume‘Dan Fenghou’×P．davidiana‘Alba’．

圖版Ⅰ 1～9．不同雜交組合花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)過(guò)程熒光觀察：1．‘江梅’×山桃，4h花粉粒萌發(fā)，×200；2．‘江梅’×山桃，8h后胼胝質(zhì)沉積，×100；3．‘江梅’×山桃，花粉管末端彎曲、膨大，×100；4．‘江梅’ב白花’山桃，48h后花粉管彎曲、纏繞、斷裂，×100；5．‘淡豐后’×山桃，4h后花粉粒在柱頭大量萌發(fā)，×100；6．‘淡豐后’×山桃，48h后花粉管進(jìn)入花柱中部，×100；7．‘淡豐后’ב白花’山桃，4h后花粉萌發(fā)，×200；8．‘淡豐后’ב白花’山桃，12h花粉管在花柱中延伸，×100；9．‘淡豐后’ב白花’山桃，96h后進(jìn)入子房，×400。10～13．胚培養(yǎng)及雜種苗：10．‘淡豐后’ב白花’山桃雜種胚培養(yǎng)情況；11．‘淡豐后’×山桃雜種胚培養(yǎng)情況；12．‘淡豐后’×山桃雜種苗；13．‘淡豐后’ב白花’山桃雜種苗。