齊鳳慧，孫宏冉，詹亞光，2＊

（1 東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040；2 東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040）

隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和公共數(shù)據(jù)庫(kù)開放，為SSR（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記開發(fā)提供了新途徑。在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中可快速獲得各種動(dòng)植物、不同組織、不同發(fā)育階段的基因表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST），這些EST 序列不僅在新基因挖掘中發(fā)揮了重要作用，而且為SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了一個(gè)巨大、有價(jià)值的來(lái)源［1－2］。

SSR 是微衛(wèi)星標(biāo)記，又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成串聯(lián)重復(fù)序列，SSR含量豐富且遍布整個(gè)基因組。而EST－SSR 標(biāo)記是建立在表達(dá)序列標(biāo)簽上的一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，并與功能基因直接相關(guān)［3］。EST－SSR 除了具有基因組SSR 的優(yōu)點(diǎn)外，它反映的是轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異，其多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)［4］。而且由于EST－SSR 來(lái)源于表達(dá)的基因組區(qū)域［5］，可直接反映相關(guān)基因的多樣性，同時(shí)它在不同物種間有良好的通用性［6］，從一種物種開發(fā)的SSR 標(biāo)記可用于其他物種的研究。目前，EST－SSR 除了在農(nóng)作物小麥（Triticumaestivum）［7］、苜蓿（Medicagosativa）［8］、葡萄（Vitisvinifera）［9］、水 稻（Oryzasativa）［10］等中應(yīng)用外，在樹木中也得到廣泛應(yīng)用，如杏（Prunus armeniaca）［11］、獼猴桃（Actinidiachinensis）［12］、云杉（Piceaasperata）［13］、火 炬 松（Pinustaeda）［14］、白樺（Betulaplatyphylla）［15］、楊 樹（Populus）［16］、茶樹（Camelliasinensis）［17］、桉樹（Eucalyptus）［18］、橡膠樹（Heveabrasiliensis）［19］等物種。

水曲柳（FraxinusmandshuricaRupr．）以材質(zhì)優(yōu)良而著稱，是珍貴的用材樹種，可制各種家具、樂(lè)器、體育器具、車船、機(jī)械及特種建筑材料。其稀有珍貴的特性不僅在物種多樣性、生態(tài)多樣性的研究上具有重要意義，而且在維持生態(tài)功能上以及生產(chǎn)實(shí)踐中所表現(xiàn)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值也是不可替代的。國(guó)務(wù)院于1999年8月4日批準(zhǔn)的《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》（第一批）將水曲柳列為二級(jí)保護(hù)植物［20－21］。

水曲柳雌雄異株，幼苗期無(wú)法辨別雌雄，只有生長(zhǎng)到10～12年開花后才能辨別雌雄［22］，這給育苗、造林以及種子園的建立帶來(lái)極大不便。目前對(duì)于水曲柳雌雄差異的研究比較少，而在其它植物中的研究表明雌雄株之間的基因表達(dá)存在一定差異，因此，為從基因方面揭示水曲柳雌雄差異，我們利用ESTSSR 技術(shù)對(duì)水曲柳雌雄株進(jìn)行分析，初步建立水曲柳雌雄株的鑒別方法，為水曲柳育種及種子園的建立提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1．1 材 料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)材料 研究材料主要來(lái)自黑龍江省尚志市葦河林業(yè)局青山林木種子園（1989建成），選擇雌雄株各100棵，取其葉片，－80℃保存。

1．1．2 EST序列來(lái)源 實(shí)驗(yàn)中水曲柳EST 序列來(lái)源：（1）來(lái)自NCBI（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）dbEST 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：／／www．ncbi．nih．gov／bdEST／index．heml）中白臘屬（Fraxinus）的EST 序列；（2）本實(shí)驗(yàn)室在華大基因測(cè)得的水曲柳轉(zhuǎn)錄組。

1．2 方 法

1．2．1 水曲柳SSRs位點(diǎn)的搜索 將獲得的EST序列進(jìn)行冗余性查找（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／vecScreen），去除EST序列中的載體序列。然后對(duì)于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST 序列利用在線軟件SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）（http：／／www．gram ene．org／db／markers／ssrtool）進(jìn)行搜索，搜索條件為3次重復(fù)以上，選取二、三、四、五、六核苷酸5種類型的SSRs；對(duì)于轉(zhuǎn)錄組序列，搜索條件是5次重復(fù)以上，選取二、三、四、五、六核苷酸5種類型的SSRs進(jìn)行分析。根據(jù)公式：SSR 頻率＝SSR 數(shù)量÷序列總數(shù)計(jì)算SSR 頻率。

1．2．2 SSRs引物的設(shè)計(jì) 利用primer 5．0軟件設(shè)計(jì)引物。來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST 序列，共得到105對(duì)EST－SSR 引物；來(lái)自水曲柳轉(zhuǎn)錄組中的序列，共設(shè)計(jì)1 678對(duì)引物，隨機(jī)合成127對(duì)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，共合成232對(duì)。

1．2．3 水曲柳DNA的提取、檢測(cè)及DNA樣品池建立 用改良的CTAB 法分別提取成年水曲柳雌雄各100株葉片DNA。分別用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 質(zhì)量及濃度，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，用ddH2O 將DNA 濃度調(diào)整為同一濃度。隨機(jī)選擇雌雄DNA 各50個(gè)，各取1μL 分別混合成水曲柳雌雄DNA 樣品池。

1．2．4 水曲柳SSR擴(kuò)增及引物篩選 以水曲柳雌雄DNA 樣品池為模板，對(duì)合成的232對(duì)SSR 引物進(jìn)行篩選。參考不同引物的Tm 值，采用梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度篩選時(shí)在（Tm－5℃）～（Tm－3℃）之間設(shè)置3個(gè)溫度梯度，SSR 擴(kuò)增體系（20 μL）為：10×buffer 2．0μL；dNTPs 1．6μL；DNA 模板（20μg／μL）2．0μL；rTaq0．2μL；引 物1（10 μmol／L）1μL；引物2（10μmol／L）1μL；ddH2O 12．2μL［23］。擴(kuò)增產(chǎn)物用12%的聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，參照韓永亮［24］的電泳和銀染方法。

2 結(jié)果與分析

2．1 水曲柳SSRs出現(xiàn)頻率、類型及分布比例

從來(lái)自白蠟屬EST 和水曲柳轉(zhuǎn)錄組中的5 423條和179 502條序列中，分別查找到9 488個(gè)和3557個(gè)SSR 位點(diǎn)，共13 045個(gè)。SSR 出現(xiàn)的頻率分別是174．96%和1．98%，平均0．32kb和13．87 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR，長(zhǎng)度≥10bp的SSR 出現(xiàn)頻率分別是3．41%和1．98%。白蠟屬EST 中SSR 出現(xiàn)頻率比水曲柳轉(zhuǎn)錄組序列中出現(xiàn)的頻率高（表1）。

表2顯示，全部的EST－SSR 包括2～6個(gè)核苷酸重復(fù)單元，其中二核苷酸重復(fù)所占比例最大約68．83%（8 979 次）；其次是三核苷酸占總SSR 的28．69%（3 743次）；五核苷酸的重復(fù)出現(xiàn)的比較少只有46個(gè)，占總SSR 的0．35%；通過(guò)對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)SSR 位點(diǎn)的比較發(fā)現(xiàn)白蠟屬EST 數(shù)據(jù)庫(kù)SSR 中二核苷酸和四核苷酸所占的比例比水曲柳轉(zhuǎn)錄組的高，分別多14．82%和0．25%；而水曲柳轉(zhuǎn)錄組SSR的三、五和六核苷酸所占的比例比白蠟屬EST 數(shù)據(jù)庫(kù)的高，分別多13．7%、0．29%和1．07%（表2）。

2．2 水曲柳EST－SSR中重復(fù)基元的分布特征

2．2．1 白蠟屬中EST－SSR 的特性 在來(lái)源于白蠟屬EST－SSR序列中，共觀察到131種重復(fù)基元（考慮堿基互補(bǔ)的前提下）。其中二核苷酸重復(fù)基元有4種，三、四、五和六核苷酸重復(fù)基元分別有18、44、20和45種。二核苷酸基元（AG／CT）n出現(xiàn)的最多（3 458次），占二核苷酸重復(fù)的50．01%，其次分別是（AC／GT）n（24．47%）和（AT／AT）n（24．23%），（CG／CG）n出現(xiàn)的較少（89次）（1．29%）。三核苷酸基元中（AAG／TTC）n出現(xiàn)最多（491次），占三核苷酸重復(fù)的20．73%，（ACC／GGT）n 和（AGG／CCT）n出現(xiàn)的頻率也較高，分別占三核苷酸重復(fù)的9．29%（220次）和6．46%（153次）。四核苷酸基元中（AAAT／TTTA）n出現(xiàn)的最多，占四核苷酸基元的16．15%（21 次），其次是（AAAG／TTTC）n 和（AATA／TATT）n，分別占四核苷酸重復(fù)的12．31%（16次）和7．69%（10次）。五核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)的頻率比較低只有26個(gè)。搜索結(jié)果得到50個(gè)六核苷酸基元，出現(xiàn)最多的是（AAAAAT／ATTTTT）n（4次）。

表1 SSR 出現(xiàn)頻率Table 1 Frequency of SSR

總之，白蠟屬EST－SSR 以二核苷酸為主導(dǎo)，（AG／CT）n出現(xiàn)的最多，占總SSR 的36．45%；其次分別是（AC／GT）n（17．83%）和（AT／AT）n（17．65%），而三、四、五和六核苷酸在總SSR 中所占比例都很小。

2．2．2 水曲柳轉(zhuǎn)錄組中EST－SSR 的特性 在來(lái)源于水曲柳轉(zhuǎn)錄組的SSR 序列中，共觀察到102種重復(fù)基元（考慮堿基互補(bǔ)的前提下）（圖1）。其中二核苷酸重復(fù)基元有4種，三、四、五和六核苷酸重復(fù)基元分別有10、13、18和57種。二核苷酸基元（AG／CT）n出現(xiàn)最多（1 554 次），占二核苷酸重復(fù)的75．25%，其次分別是（AC／GT）n（16．71%）和（AT／AT）n（7．51%），（CG／CG）n出現(xiàn)較少（11 次）（0．53%）。三核苷酸基元中（AAG／CTT）n出現(xiàn)最多（412 次），占三核苷 酸 重 復(fù) 的29．96%，（ACC／GGT）n和（AGC／CTG）n出現(xiàn)的頻率也較高，分別占三核苷酸重復(fù)的19．71%（271 次）和11．64%（160次）。四、五和六核苷酸出現(xiàn)的都比較少，但是六核苷酸類型豐富。

表2 水曲柳SSRs類型及分布比例Table 2 Repeat types and percentage of SSRs of F．mandshurica

通過(guò)以上分析可知，兩種序列來(lái)源中EST－SSR的特性相同，出現(xiàn)的SSR 位點(diǎn)較多、類型豐富，都是以二核苷酸為主導(dǎo)，三、四、五和六核苷酸在總SSR中所占比例都很小。二核苷酸基元（AG／CT）n 出現(xiàn)的最多（5 012次），占總SSR 的38．42%，其次分別是（AC／GT）n（2 037 次）和（AT／AT）n（1 830次）。三核苷酸基元中，（AAG／CTT）n 出現(xiàn)最多（903 次），占 總SSR 的6．92%。四核苷酸中（AAAT／ATTT）n出現(xiàn)的最多，占總SSR的0．23%。五核苷酸（AAAAG／TTTTC）n 出現(xiàn)的最多，占總SSR 的0．09%。六核苷酸出現(xiàn)的次數(shù)不多，但類型豐富（圖1）。

2．3 水曲柳EST－SSR引物篩選及應(yīng)用

2．3．1 水曲柳DNA 提取與檢測(cè) 采用CTAB 法提取水曲柳葉片中的DNA，用RnaseA 消化后在1．0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)其完整性，從圖2中可看出DNA 條帶清晰，點(diǎn)樣孔也較干凈，沒(méi)有大分子物質(zhì)的干擾。之后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，各樣品A260／A280均約等于1．8，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2．3．2 EST－SSR 引物第一輪篩選 分別以水曲柳雌、雄DNA 樣品池為模板，對(duì)設(shè)計(jì)的232對(duì)SSR 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示208（89．66%）對(duì)引物獲得有效擴(kuò)增，其中158 對(duì)（68．10%）引物在雌雄DNA 中無(wú)差異，有20對(duì)引物擴(kuò)增的片段不在目的片段范圍內(nèi)；74對(duì)（31．90%）引物在雌雄DNA 中有差異，有27對(duì)引物擴(kuò)增的片段符合預(yù)定大小的目的條帶。在2種來(lái)源的引物中，來(lái)自白蠟屬的引物有47對(duì)在水曲柳雌雄DNA 中有差異，其中有23對(duì)的雌雄差異片段符合預(yù)定大小的目的條帶，有20對(duì)雌雄差異片段小于目的片段長(zhǎng)度（表3）；來(lái)自水曲柳轉(zhuǎn)錄組的127 對(duì)引物中，有27 對(duì)在水曲柳雌雄DNA 中有差異，其中有4對(duì)引物的雌雄差異片段符合預(yù)定大小的目的條帶，有7對(duì)引物的雌雄差異條帶小于目的片段，有16對(duì)引物的雌雄差異片段大于目的條帶（表4）。在雌雄有差異片段的74對(duì)引物中有30對(duì)引物能在雌樹的DNA 中擴(kuò)增出片段，不能在雄樹DNA 中擴(kuò)增出段；有44對(duì)引物在雌樹的DNA 中不能擴(kuò)增出片段，在雄樹DNA 中能擴(kuò)增出片段。在圖3，A 中箭頭所示，21號(hào)引物（3、4泳道）和20號(hào)引物（9、10泳道）在雌雄DNA中均能擴(kuò)增出預(yù)定大小的目的條帶，23號(hào)引物（7、8泳道）在雌雄中擴(kuò)增出條帶小于目的片段。在圖3，B中箭頭所示，73號(hào)引物（1、2、3、4泳道）和74號(hào)引物（7、8泳道）在雌樹DNA 中擴(kuò)增出符合預(yù)定大小的目的條帶，而在雄樹DNA 中沒(méi)有擴(kuò)增出條帶；75號(hào)引物（9、10、11、12泳道）在雌樹DNA 中擴(kuò)增出比目的片段長(zhǎng)度小的條帶，而在雄樹中沒(méi)有擴(kuò)增出條帶。

圖1 水曲柳SSR 分布特性圖1 Distribution characteristics of SSR in F．mandshurica

圖2 DNA 提取結(jié)果Fig．2 DNA electrophosis

表3 白蠟屬EST－SSRs引物篩選結(jié)果Table 3 Results of EST－SSRs primer screening in Fraxinus

2．3．3 EST－SSR 引物第二輪篩選 將第一輪篩選中雌雄有差異的所有引物都用于第二輪篩選，每個(gè)引物分別以雌雄各15個(gè)單株DNA 為模板，擴(kuò)增結(jié)果顯示來(lái)自水曲柳轉(zhuǎn)錄組中的19和56號(hào)引物在水曲柳雌雄各15個(gè)單株中均有差異。圖4，A 是來(lái)自白蠟屬EST 的44和26號(hào)引物，可以看出在雌雄間沒(méi)有明顯差異，圖4，B 是來(lái)自轉(zhuǎn)錄組56號(hào)引物部分結(jié)果，在40～80bp處雄樹DNA 中均擴(kuò)增出小于目的條帶的多態(tài)性片段，而雌樹DNA 中均沒(méi)有這樣的多態(tài)性條帶。圖4，C 是19號(hào)引物部分?jǐn)U增結(jié)果，如箭頭所示，在雌樹DNA 中擴(kuò)增出符合預(yù)定大小的目的條帶，而雄樹DNA 中沒(méi)有擴(kuò)增出同樣大小的條帶。

2．3．4 EST－SSR 在水曲柳中的應(yīng)用 將第二輪篩選得到的19號(hào)和56號(hào)引物應(yīng)用于200棵成年水曲柳的雌雄差異分析中，56號(hào)引物在100株雌樹中有18株在80bp處擴(kuò)增出片段，82株沒(méi)有擴(kuò)增出片段（圖5，A），差異率是82．00%；在100株雄樹中有3株在80bp處沒(méi)有片段，97 株有片段，而且均出現(xiàn)多態(tài)性擴(kuò)增片段（圖5，B），差異率是97．00%。因此，56號(hào)引物在200株水曲柳成年雌雄樹中雌雄差異率是89．50%。

19號(hào)引物在100株雌樹中有38株在300～500 bp之間擴(kuò)增出片段，如圖6箭頭所示，62株沒(méi)有擴(kuò)增出片段，差異率是38．00%；在100株雄樹中有91株在300～400bp之間沒(méi)有擴(kuò)增出片段，9株擴(kuò)增出片段，差異率是91．00%，19號(hào)引物在200株水曲柳成年樹中雌雄差異率是64．50%。

表4 轉(zhuǎn)錄組EST－SSRs引物篩選結(jié)果Table 4 Results of EST－SSRs primer screening in transcriptome

圖3 部分引物篩選結(jié)果Fig．3 Primers screening for EST－SSR analysis

圖4 第二輪部分引物篩選結(jié)果Fig．4 Results of primer screening in the second round

3 討 論

圖5 56號(hào)引物雌雄鑒別部分圖Fig．5 Results of primer 56

圖6 19號(hào)引物雌雄鑒別部分圖Fig．6 Results of primer 19

SSR 不僅分布于整個(gè)基因組中，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，也廣泛存在于EST 序列中。EST 序列開發(fā)的EST－SSR標(biāo)記與傳統(tǒng)的基因組SSR 標(biāo)記相比有很多優(yōu)點(diǎn)，如：EST－SSR 標(biāo)記在物種間具有高通用性，通常都代表著某種基因功能，還可反映出轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異，而且開發(fā)過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低［25］。目前，EST－SSR 已在農(nóng)作物和木本植物中廣泛應(yīng)用。Silfverberg－Dilworth等［26］利用148個(gè)蘋 果SSR 引物（包含31個(gè)EST－SSR）和8個(gè)已知的蘋果、梨和歐洲花楸SSR 標(biāo)記構(gòu)建了復(fù)合遺傳圖譜，這些SSR標(biāo)記給原參考圖譜新增了168個(gè)位點(diǎn)。通常ESTSSR 側(cè)翼序列在物種之間高度保守，因此可以在一個(gè)物種中開發(fā)EST－SSR 應(yīng)用于與它親緣的物種中。Vendramin等［27］從桃（P．persica）的中果皮中開發(fā)了21對(duì)EST－SSR 引物，用22個(gè)桃DNA 篩選出18對(duì)引物均能有效擴(kuò)增出條帶，同時(shí)用這18對(duì)引物在李屬（Prunus）的6 個(gè)其它植物中均擴(kuò)增出了預(yù)期條帶，說(shuō)明EST－SSR 在李屬近緣種植物之間具有高效的通用性。本研究在105 對(duì)白蠟屬EST－SSR引物和127對(duì)水曲柳轉(zhuǎn)錄組SSR 引 物中，分別有81和127對(duì)引物能有效擴(kuò)增，說(shuō)明EST－SSR 在近緣或遠(yuǎn)緣物種之間均有較好的通用性。

要將EST－SSR 應(yīng)用于植物中，關(guān)鍵的第一步就是要進(jìn)行對(duì)EST 序列中SSR 位點(diǎn)的分析及引物設(shè)計(jì)。劉澤濤等［28］用SSRSCAN 軟件對(duì)小麥穗部的3264條EST 序列進(jìn)行SSR 位點(diǎn)查找，得到108條含有SSR 標(biāo)記的序列，設(shè)計(jì)64對(duì)引物篩選得到41對(duì)能在小麥品種中擴(kuò)增出條帶，36對(duì)引物能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶。Chabane等［29］設(shè)計(jì)了48對(duì)大麥的EST－SSR 引物，并從中篩選出15 對(duì)引物在大麥中能有效擴(kuò)增。在EST－SSR 研究中，李響等［30］對(duì)臘梅轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SSR 位點(diǎn)分析并設(shè)計(jì)了100對(duì)ESTSSR 引物，篩選出17對(duì)引物在臘梅中能有效擴(kuò)增。本研究共合成了232對(duì)引物，篩選到208對(duì)引物在水曲柳中能有效擴(kuò)增，其中有74對(duì)引物在水曲柳雌雄DNA 中存在差異，占所有引物的31．90%。

隨著植物基因組學(xué)與功能基因組學(xué)的不斷發(fā)展和研究的深入，大規(guī)模植物基因的測(cè)序產(chǎn)生了大量的EST 序列，并上傳到核酸公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，因此，要進(jìn)一步利用EST 序列信息，其中之一就是要對(duì)EST－SSR 的引物進(jìn)行開發(fā)。李德軍等［31］對(duì)來(lái)自NCBI和馬來(lái)西亞橡膠樹EST 數(shù)據(jù)庫(kù)的EST 序列進(jìn)行分析，共鑒定到566個(gè)SSR 位點(diǎn)，平均3．96kb出現(xiàn)一個(gè)SSR 位點(diǎn)。在火炬松和云杉EST 序列中平均49．8kb出現(xiàn)1個(gè)SSR 位點(diǎn)，在楊樹EST 序列中平均每3．88kb出現(xiàn)1個(gè)SSR 位點(diǎn)［16］。在一些物種中，二核苷酸和三核苷酸重復(fù)序列占主要類型，如橡膠樹中二核苷酸重復(fù)占主要類型，其次是三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)，二核苷酸中GA／CT 的數(shù)目最多，其次是TC／AG、AT／TA、CTT／GAA、TTC／AAG 和TCT／AGA［31］。甘蔗EST 中三核苷酸重復(fù)占90%［32］；蝴蝶蘭EST 中二核苷酸重復(fù)占67．10%［33］；白樺EST 中二核苷酸重復(fù)占81．12%［15］。本研究中水曲柳轉(zhuǎn)錄組中的SSR 出現(xiàn)的頻率較低為1．98%，在白蠟屬EST 中每0．32kb出現(xiàn)一個(gè)SSR 位點(diǎn)，出現(xiàn)的頻率較高。水曲柳中也是二核苷酸重復(fù)序列占主導(dǎo)，最高為72．87%，二核苷酸（AG／CT）n出現(xiàn)的頻率最多為38．42%。水曲柳中的三核苷酸（AAG／CTT）n 與楊樹（9．3%）、杏（28．76%）［34］、油菜（35．71）［35］等報(bào)道一致。

水曲柳雌雄葉片的EST－SSR 標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用對(duì)水曲柳育種及種子園建立具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，一方面，對(duì)兩種來(lái)源的標(biāo)記均具有較高的有效擴(kuò)增效率，表明利用近緣植物的分子標(biāo)記對(duì)水曲柳進(jìn)行研究是一種有效可行的方法；另一方面，導(dǎo)致水曲柳有性繁殖和種子園建立的難點(diǎn)關(guān)鍵是幼年水曲柳很難分辨雌雄，而目前關(guān)于水曲柳雌雄鑒別的研究基本空白。構(gòu)建更加全面的水曲柳雌雄ESR－SSR標(biāo)記并利用其來(lái)進(jìn)行雌雄差異基因的定位，將是下一步的工作重點(diǎn)。

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