何 斐,張忠良,劉列平,崔 鳴,薛泉宏
(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊陵712100;2西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院,陜西楊陵712100;3陜西省嵐皋縣魔芋局,陜西嵐皋725400;4 陜西省安康市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,陜西安康725000;5 秦巴魔芋研究開(kāi)發(fā)中心,陜西安康725000;6 西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院,陜西楊陵712100)
采樣區(qū)概況:采樣區(qū)嵐皋縣位于陜西省安康市西南部、大巴山北麓,屬北亞熱帶季風(fēng)性氣候,年均氣溫15.1℃,年均降水量1 058 mm,全縣60%以上行政村海拔為800~1 300m[3]。
供試樣品:為有效減輕魔芋病害,充分利用林地資源及遮蔭,選擇刺槐林下套種魔芋(稱刺槐林魔芋)和農(nóng)田玉米下套種魔芋(稱農(nóng)田魔芋)。其中,刺槐林地海拔650m,刺槐樹(shù)齡5年,株行距1.5m×2 m,郁閉度60%,魔芋株行距40cm×40cm。農(nóng)田中玉米套種魔芋行數(shù)比例為玉米∶魔芋=1∶2,蔭閉度60%,魔芋株行距40cm×40cm。于2011-08-19在嵐皋縣藺河鄉(xiāng)立新村刺槐林下,采集健康刺槐林魔芋全植株及其根區(qū)、根表及根外土壤;同時(shí)采集相同生態(tài)條件下農(nóng)田中與玉米間作的健康農(nóng)田魔芋全植株及其根區(qū)、根表與根外土壤,作為刺槐林魔芋對(duì)照。將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室參照周永強(qiáng)等[9]方法及時(shí)分離。
培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯蔗糖及高氏1號(hào)培養(yǎng)基[10]。
1.2.1 土壤微生物分離計(jì)數(shù) 采用稀釋平板涂抹法分離計(jì)數(shù)微生物數(shù)量。細(xì)菌、真菌及放線菌分別采用牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯蔗糖及高氏1號(hào)培養(yǎng)基,均設(shè)3個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度重復(fù)3皿,28℃倒置培養(yǎng),細(xì)菌2d,真菌3d,放線菌8d后計(jì)數(shù),同時(shí)挑取優(yōu)勢(shì)菌純化后于斜面培養(yǎng)基保藏。
1.2.2 土壤pH 及養(yǎng)分測(cè)定 使用DELTA 320pH 計(jì)測(cè)定土壤pH(水∶土=5∶1);重鉻酸鉀氧化-外加熱法測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量;NH4-N 采用2 mol·L-1KCl浸提,流動(dòng)分析儀測(cè)定;速效P 含量采用0.5mol·L-1NaHCO3浸提,鉬銻抗比色法測(cè)定;速效K 含量采用1mol·L-1NH4OAc浸提,火焰光度法測(cè)定[11]。
1.2.3 優(yōu)勢(shì)菌株鑒定 細(xì)菌、放線菌總DNA 提取參照徐麗華等[12-15]方法。均采用細(xì)菌16SrRNA 通用 引 物PA(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、PB(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,得到1.4~1.5kp片段。PCR 條件:94℃預(yù)變性4min,94℃變性1min,57℃退火55 s,72℃延伸2min,變性至延伸30個(gè)循環(huán),72℃延伸10min,4℃保存。
真菌:參照文獻(xiàn)[16~18]方法提取真菌總DNA。采用真菌通用引物ITS1、ITS4 對(duì)rDNAITS序列進(jìn)行擴(kuò)增(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),得到400~500bp 片段。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,50℃退火30 s,72℃延伸40s,變性至延伸30個(gè)循環(huán),72℃延伸10min,4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序,采用BLAST 方法和CLUSTALX 2.0軟件將獲得的序列與NCBI中高相似度序列進(jìn)行同源性比對(duì),Mega 5.0軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
(2)語(yǔ)言文字:來(lái)稿力求做到文字通順、精煉,邏輯性強(qiáng),避免口語(yǔ)化和非專業(yè)用語(yǔ)。使用國(guó)家規(guī)范漢字,不用繁體字和非規(guī)范的簡(jiǎn)化字,遵守規(guī)范化的標(biāo)點(diǎn)符號(hào)使用規(guī)則。
1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。刺槐林魔芋各項(xiàng)指標(biāo)較農(nóng)田的增率均用⊿CK%表示,用公式(1)計(jì)算。供試樣品中某種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌數(shù)量占該樣品中細(xì)菌總數(shù)的比例用P%表示,按公式(2)計(jì)算;某種優(yōu)勢(shì)真菌及放線菌所占比例計(jì)算與細(xì)菌相同。
由表1可知,刺槐林魔芋根外土中細(xì)菌、真菌及放線菌數(shù)量與農(nóng)田魔芋無(wú)明顯差異,但刺槐林魔芋根區(qū)土中真菌數(shù)量較農(nóng)田魔芋減少74.4%;細(xì)菌和放線菌數(shù)量分別較農(nóng)田魔芋減少14.2%和6.4%,但差異均不顯著;刺槐林魔芋根表土壤細(xì)菌數(shù)量較農(nóng)田魔芋增加588.9%,放線菌數(shù)量顯著減少23.0%,但二者真菌數(shù)量無(wú)顯著差異。
表1 魔芋根區(qū)、根表及根外土壤微生物數(shù)量Table 1 Microbial quantity in the rhizosphere,rhizoplane and bulk soils of A.konjac
由表2可知,從魔芋根外、根區(qū)及根表土壤中共獲得17株優(yōu)勢(shì)菌株,其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和優(yōu)勢(shì)真菌各6株,優(yōu)勢(shì)放線菌5 株。采用16SrRNA 和rDNAITS基因序列分析技術(shù)對(duì)優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行分子鑒定。
2.2.1 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌 由表3可知,刺槐林地土壤與農(nóng)田土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌不同。刺槐林魔芋根外土壤中各優(yōu)勢(shì)細(xì)菌數(shù)量與農(nóng)田魔芋存在明顯差異:其中,刺槐林魔芋根外土中放射型根瘤菌(R.radiobacter)和蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)數(shù)量分別較農(nóng)田魔芋增加140.5%和28.3%;而產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C.indologenes)、變形假單胞菌(P.plecoglossicida)及寡養(yǎng)食單胞菌(S.pavani)分別較農(nóng)田魔芋減少100.0%、12.3%及12.7%。
由表3可知,根區(qū)土壤中,刺槐林土壤與農(nóng)田土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌數(shù)量也呈類似趨勢(shì):刺槐林魔芋根區(qū)土中蘇云金芽孢桿菌和摩氏假單胞菌(P.mosselii)數(shù)量均高于農(nóng)田魔芋,其中蘇云金芽孢桿菌較農(nóng)田高107.4%,而產(chǎn)吲哚金黃桿菌、變形假單胞菌及寡養(yǎng)食單胞菌分別較農(nóng)田魔芋減少57.4%、83.1%及100.0%。
從表3可知,4株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌數(shù)量在刺槐林魔芋與農(nóng)田魔芋根表土中的差異更為明顯:刺槐林魔芋根表土中放射型根瘤菌、蘇云金芽孢桿菌數(shù)量分別為農(nóng)田魔芋根表土的25.7、13.0倍;摩氏假單胞菌在刺槐林魔芋根表土中數(shù)量高達(dá)2.64×108CFU·g-1,但在農(nóng)田魔芋根表土壤中未檢出。表明優(yōu)勢(shì)細(xì)菌放射型根瘤菌、蘇云金芽孢桿菌及摩氏假單胞菌的大量存在與維持刺槐林魔芋健康高產(chǎn)有關(guān)。產(chǎn)吲哚金黃桿菌在刺槐林下魔芋根表土中未檢出,但在農(nóng)田魔芋根表土中檢出量為3.52×107CFU·g-1。
從表3 中6 種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌占細(xì)菌總數(shù)的比例來(lái)看,放射型根瘤菌、蘇云金芽孢桿菌、摩氏假單胞菌在魔芋根表及根外土壤細(xì)菌總數(shù)中所占比例均表現(xiàn)為刺槐林大于農(nóng)田魔芋的趨勢(shì)。產(chǎn)吲哚金黃桿菌、變形假單胞菌、寡養(yǎng)食單胞菌在魔芋根區(qū)、根表及根外土壤細(xì)菌總數(shù)中所占比例均表現(xiàn)為農(nóng)田魔芋大于刺槐林的趨勢(shì)。
此外,從表3可知,刺槐林和農(nóng)田魔芋根表土中6種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的總數(shù)量高于根區(qū)、根外土壤,其分別是根區(qū)土壤的31.9倍和1.3倍,根外土壤的62.1倍和4.4倍,表明根表土中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌數(shù)量多,對(duì)魔芋生長(zhǎng)的影響起關(guān)鍵作用。若優(yōu)勢(shì)菌為有益菌,則魔芋健康高產(chǎn);若為有害菌,則多病低產(chǎn)。
2.2.2 優(yōu)勢(shì)真菌 由表4可知,刺槐林與農(nóng)田魔芋根外、根區(qū)及根表土中各優(yōu)勢(shì)真菌數(shù)量差異均呈現(xiàn)相同趨勢(shì):即在刺槐林魔芋根區(qū)、根表及根外土壤中,優(yōu)勢(shì)真菌黒附球菌(E.nigrum)、疣孢青霉(P.verruculosum)數(shù)量遠(yuǎn)高于農(nóng)田魔芋;而在農(nóng)田魔芋根區(qū)、根表及根外土壤中,腐皮鐮刀菌(F.solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、變灰青霉(P.canescen)及煙曲霉(A.fumigatus)數(shù)量均高于刺槐林。結(jié)果表明,優(yōu)勢(shì)真菌黒附球菌、疣孢青霉的存在與維持魔芋健康生長(zhǎng)有關(guān),其余4 種真菌中的腐皮鐮刀菌(F.solani)和尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)則是已知病原菌。
表2 魔芋根區(qū)、根表及根外土壤優(yōu)勢(shì)微生物Table 2 Dominant microorganisms in the rhizosphere,rhizoplane and bulk soils of A.konjac
表3 魔芋根區(qū)、根表及根外土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌數(shù)量和比例Table 3 Quantity and percent of dominant bacteria in the rhizosphere,rhizoplane and bulk soils of A.konjac
表4 魔芋根區(qū)、根表及根外土壤優(yōu)勢(shì)真菌數(shù)量和比例Table 4 Quantity and percent of dominant fungi in the rhizosphere,rhizoplane and bulk soils of A.konjac
從優(yōu)勢(shì)真菌占真菌總數(shù)的比例來(lái)看,刺槐林和農(nóng)田魔芋根外、根區(qū)及根表土壤優(yōu)勢(shì)真菌所占比例的高低與二者數(shù)量的大小趨勢(shì)一致。
2.2.3 優(yōu)勢(shì)放線菌 由表5可知,在根外土中,刺槐林魔芋根外土中優(yōu)勢(shì)放線菌綠淀粉酶鏈霉菌(S.viridodiastaticus)和 淀 粉 酶 產(chǎn) 色 鏈 霉 菌(S.diastatochromogenes)數(shù)量均為1.07×105CFU·g-1,而這兩種菌在農(nóng)田魔芋根外土壤中均未檢出。根外土壤中優(yōu)勢(shì)放線菌瘡疥鏈霉菌(S.scabiei)的數(shù)量呈現(xiàn)農(nóng)田大于刺槐林的趨勢(shì)。根區(qū)土壤中,優(yōu)勢(shì)放線菌綠淀粉酶鏈霉菌和瘡疥鏈霉菌在刺槐林和農(nóng)田魔芋根區(qū)土壤中的數(shù)量差異與根外土壤中呈現(xiàn)類似趨勢(shì):即綠淀粉酶鏈霉菌的數(shù)量表現(xiàn)為刺槐林大于農(nóng)田;而瘡疥鏈霉菌的數(shù)量表現(xiàn)為農(nóng)田魔芋大于刺槐林的趨勢(shì)。與根外土壤趨勢(shì)相反,優(yōu)勢(shì)放線菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的數(shù)量在根區(qū)土壤中表現(xiàn)為農(nóng)田魔芋大于刺槐林。
由表5可知,根表土壤中,4種優(yōu)勢(shì)放線菌的數(shù)量表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性:即黃暗色鏈霉菌(S.xanthophaeus)、纖維素鏈霉菌(S.cellulosae)及瘡疥鏈霉菌(S.scabiei)數(shù)量呈現(xiàn)農(nóng)田魔芋大于刺槐林的趨勢(shì);而綠淀粉酶鏈霉菌的數(shù)量在根表土中與其根外、根區(qū)土中的規(guī)律一致,即刺槐林?jǐn)?shù)量較多,但農(nóng)田魔芋根表土中未檢出。
從優(yōu)勢(shì)放線菌占放線菌總數(shù)的比例來(lái)看,刺槐林與農(nóng)田魔芋根外、根區(qū)及根表土壤優(yōu)勢(shì)放線菌所占比例的高低與二者數(shù)量大小一致。
由表6可知,刺槐林魔芋根區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)和銨態(tài)氮含量分別較農(nóng)田顯著提高39.6%和14.0%,但速效磷和速效鉀含量分別較農(nóng)田顯著降低91.3%和13.0%。刺槐林魔芋根區(qū)土壤pH 與對(duì)照無(wú)明顯差異。此外,刺槐林魔芋根外土壤pH 和有機(jī)質(zhì)含量分別較農(nóng)田顯著增加25.5%和167.6%,但銨態(tài)氮、速效磷及速效鉀含量均顯著低于農(nóng)田,降幅分別為44.0%、85.6%及12.4%。
表5 魔芋根區(qū)、根表及根外土壤優(yōu)勢(shì)放線菌數(shù)量和比例Table 5 Quantity and percent of dominant actinomycetes in the rhizosphere,rhizoplane and bulk soils of A.konjac
表6 魔芋根區(qū)及根外土壤養(yǎng)分含量Table 6 Soil nutrition contents in the rhizosphere and bulk soils of A.konjac
魔芋健康高產(chǎn)與其根際微生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。但目前對(duì)魔芋根際土壤微生態(tài)研究很少[19],尚無(wú)對(duì)刺槐林魔芋根區(qū)、根表土壤微生態(tài)特性的系統(tǒng)研究,難以對(duì)刺槐林魔芋健康高產(chǎn)現(xiàn)象作出解釋,限制了對(duì)刺槐林魔芋健康高產(chǎn)栽培技術(shù)的深入研究及對(duì)刺槐林下土壤資源的高效利用。
本研究發(fā)現(xiàn),刺槐林魔芋根區(qū)、根表及根外土壤微生物區(qū)系與農(nóng)田存在顯著差異:(1)刺槐林魔芋根區(qū)土壤真菌數(shù)量遠(yuǎn)低于農(nóng)田,根表土壤細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)高于農(nóng)田。(2)刺槐林魔芋根表、根外土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌均為放射型根瘤菌和蘇云金芽孢桿菌,根區(qū)土壤中為蘇云金芽孢桿菌和摩氏假單胞菌,刺槐林魔芋根表土壤中放射型根瘤菌數(shù)量約為農(nóng)田的26倍,而農(nóng)田魔芋根表、根外及根區(qū)土壤中上述3種細(xì)菌數(shù)量很少或未檢出。(3)刺槐林魔芋根外、根區(qū)及根表土中各優(yōu)勢(shì)真菌黒附球菌數(shù)量遠(yuǎn)高于農(nóng)田,根外土壤中疣孢青霉數(shù)量遠(yuǎn)高于農(nóng)田;而在農(nóng)田魔芋根區(qū)、根表及根外土壤中,腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、煙曲霉及變灰青霉數(shù)量均高于刺槐林。(4)刺槐林魔芋根外、根區(qū)及根表土中各優(yōu)勢(shì)放線菌為綠淀粉酶鏈霉菌,而農(nóng)田土壤未檢出該菌。刺槐林土壤中大量存在的3種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、3種優(yōu)勢(shì)真菌和1種優(yōu)勢(shì)放線菌可能是刺槐林魔芋健康高產(chǎn)的主要原因之一,農(nóng)田土壤中大量存在的4種優(yōu)勢(shì)真菌是農(nóng)田魔芋多病低產(chǎn)的主要原因之一。
已有研究[20-25]支持了上述推論。在上述刺槐林土壤優(yōu)勢(shì)微生物中,2種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌及2種優(yōu)勢(shì)真菌具有抑菌或促生效應(yīng)。其中放射型根瘤菌具有廣譜抑菌活性,能抑制番茄青枯雷爾氏菌、西瓜果斑病菌及棉花黃萎病大麗輪枝菌,尤其對(duì)西瓜果斑病菌具有極好的抑菌效果,抑菌圈直徑高達(dá)53.0 mm[20];放射型根瘤菌還能產(chǎn)生具有促生活性的代謝產(chǎn)物,其無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液以及細(xì)胞懸液均能顯著促進(jìn)甜瓜幼苗生長(zhǎng)[21]。蘇云金芽孢桿菌是目前世界上應(yīng)用范圍最廣、效果最好的綠色環(huán)保型微生物殺蟲劑,其胞內(nèi)毒蛋白對(duì)多種害蟲有殺滅作用[22-23]。該菌數(shù)量多,可能通過(guò)減少魔芋根區(qū)、根表土壤害蟲數(shù)量及害蟲對(duì)魔芋根系侵害減輕病原微生物侵染,降低軟腐病發(fā)病率。放射型根瘤菌和蘇云金芽孢桿菌能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì),抑制魔芋軟腐病原菌生長(zhǎng),在盆栽條件下亦有一定的防病促生作用(擬另文報(bào)道)。疣孢青霉對(duì)真菌性番茄早疫病菌、蘋果干腐病菌及蘋果腐爛病菌的抑菌率高達(dá)80%以上[24]。黒附球菌是防治作物病害較理想的生防菌[25]。這4 種優(yōu)勢(shì)菌在刺槐林下魔芋根區(qū)、根表及根外土壤中數(shù)量較多,對(duì)抑制土壤中有害微生物生長(zhǎng),增強(qiáng)魔芋抗病性及促進(jìn)魔芋生長(zhǎng)有益。
此外,在刺槐林下魔芋根區(qū)、根表及根外土壤中,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌摩氏假單胞菌和優(yōu)勢(shì)放線菌綠淀粉酶鏈霉菌數(shù)量較多,但在農(nóng)田魔芋根區(qū)、根表及根外土壤中未檢出,表明這兩株菌也可能與刺槐林魔芋健康高產(chǎn)有關(guān)。但目前尚無(wú)這2種菌的防病促生或抑菌功能的報(bào)道,其對(duì)刺槐林魔芋健康高產(chǎn)的影響尚待進(jìn)一步研究。
本研究還發(fā)現(xiàn),在農(nóng)田魔芋根區(qū)、根表及根外土壤中,優(yōu)勢(shì)真菌為腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌及煙曲霉;優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為產(chǎn)吲哚金黃桿菌和變形假單胞菌;優(yōu)勢(shì)放線菌為瘡疥鏈霉菌。這些優(yōu)勢(shì)菌數(shù)量遠(yuǎn)高于刺槐林土壤。這6種菌的大量存在與農(nóng)田魔芋軟腐病發(fā)病率高、產(chǎn)量低有關(guān)。已有研究[26-33]也支持了該推論。其中,腐皮鐮刀菌是一類分布廣泛的植物病原菌,可侵染辣椒、馬鈴薯、黃瓜等,導(dǎo)致作物地下根腐、地上枯萎等病害發(fā)生[26-27]。尖孢鐮刀菌是引起甘蔗、黃瓜等作物枯萎病的主要致病菌[28-32]。瘡疥鏈霉菌是引起馬鈴薯瘡疥病的植物源病原菌[33]。即這3種菌的有害作用是確定的。煙曲霉為人類真菌性疾病的致病菌[34],該菌也可產(chǎn)生一些抑制免疫反應(yīng)的真菌毒素如煙曲霉素、煙曲霉酸及內(nèi)毒素等[35]。產(chǎn)吲哚金黃桿菌是人類疾病的致病菌[36]。變形假單胞菌是魚類敗血癥致病菌[37]。但這3 種優(yōu)勢(shì)菌對(duì)植物有無(wú)致病性尚無(wú)報(bào)道。
此外,寡養(yǎng)食單胞菌、變灰青霉、淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌、黃暗色鏈霉菌、纖維素鏈霉菌在農(nóng)田魔芋根區(qū)、根表及根外土壤中數(shù)量較多,但目前尚無(wú)這些菌的致病性或影響根系吸收功能的報(bào)道,其對(duì)魔芋生長(zhǎng)有何影響尚待進(jìn)一步研究。
本研究還發(fā)現(xiàn),刺槐林土壤速效NPK、有機(jī)質(zhì)及pH 與農(nóng)田存在顯著差異。其中刺槐林根外土壤有機(jī)質(zhì)含量遠(yuǎn)高于農(nóng)田,速效NPK 則遠(yuǎn)低于農(nóng)田。魔芋根區(qū)土壤與之類似。該現(xiàn)象表明,與土壤微生物數(shù)量種類及土壤有機(jī)質(zhì)相比,土壤速效NPK 對(duì)魔芋健康高產(chǎn)的影響較小。
綜上所述,刺槐林魔芋健康高產(chǎn)的微生態(tài)機(jī)制為:(1)土壤具有健康有益的微生物區(qū)系。(2)土壤有機(jī)質(zhì)含量高。刺槐的枯枝落葉及根系分泌物可能是土壤中有益優(yōu)勢(shì)微生物大量繁殖的主要原因,但該推測(cè)尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。
本研究通過(guò)對(duì)比刺槐林與農(nóng)田魔芋根區(qū)、根表、根外土壤微生物區(qū)系及養(yǎng)分差異,首次揭示了刺槐林魔芋健康高產(chǎn)的微生態(tài)機(jī)制,該結(jié)果可為刺槐林魔芋健康高產(chǎn)栽培研究提供理論依據(jù)。
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