魏 明，楊超英，孔 芳，柴瑞娟

（安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000）

蘭科菌根（orchid mycorrhizas，OM）是真菌與蘭科植物形成的共生體，共生體雙方互惠互利［1］。真菌菌絲體可侵入到蘭科植物根系細(xì)胞內(nèi)，菌絲體向外延伸到植物根系達(dá)不到的基質(zhì)中，從基質(zhì)中吸收營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)植物生長(zhǎng)［2－3］。絕大多數(shù)蘭科植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都能與相應(yīng)真菌建立共生關(guān)系。

鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimura et Migo）為蘭科石斛屬植物，富含多糖和生物堿等活性成分，是珍稀藥用植物［4］。鐵皮石斛自然繁殖率低，加上人工大量采摘，野生鐵皮石斛已瀕臨滅絕。隨著植物組培技術(shù)的發(fā)展，鐵皮石斛離體繁殖技術(shù)已基本成熟，可以實(shí)現(xiàn)工廠化育苗［5－6］；但是組培苗移栽后的成活率較低，且生長(zhǎng)緩慢，這和缺少與之共生的真菌有關(guān)。有益的真菌能促進(jìn)蘭科植物的生長(zhǎng)發(fā)育［7］。菌根技術(shù)是目前國(guó)際上先進(jìn)的一種真菌肥料技術(shù)，通過(guò)菌根技術(shù)能極大地提高植物的生長(zhǎng)速度和抗逆性，促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物的合成［8］。如何提高石斛菌根共生體的形成效率是石斛菌根化栽培的重要問(wèn)題。

稀土具有重要的生理功能，其可與細(xì)胞內(nèi)的多糖、蛋白質(zhì)和核酸等形成比較穩(wěn)定的化合物，從而影響細(xì)胞的生理生化代謝過(guò)程，提高微生物的生物活性［9－10］。鑭的化學(xué)性質(zhì)很活潑且副作用小。研究表明，硝酸鑭可促進(jìn)鹽脅迫下小麥幼苗的生長(zhǎng)，提高其保護(hù)酶活性，降低膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物含量，增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性［11］。硝酸鑭、硝酸鈰等能促進(jìn)細(xì)莖石斛組培苗的生長(zhǎng)，提高其生理活性［12］。但關(guān)于稀土和OM 菌根真菌的聯(lián)合使用對(duì)石斛生理特性的影響鮮有報(bào)道。我們從野生的石斛中分離出有效菌根真菌，探討稀土鑭和菌根真菌聯(lián)合使用對(duì)鐵皮石斛生理特性的影響，以期為應(yīng)用稀土和菌根技術(shù)提高藥用石斛的栽培效率及其藥用品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料和試劑

鐵皮石斛無(wú)菌苗由安徽工程大學(xué)組培基地提供，菌根真菌為本實(shí)驗(yàn)室從野生金釵石斛中分離的絲核菌（編號(hào)OM12），由本實(shí)驗(yàn)室保存。栽培培養(yǎng)基為樹(shù)皮和碎石，營(yíng)養(yǎng)液為MS培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分。所有化學(xué)試劑均為分析純。

1．2 接種菌劑的制備和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將OM12 真菌接種在PDF 液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)4～6d，得到液體菌劑備用，菌體濃度約為2×106cfu·mL－1。試驗(yàn)菌根真菌處理設(shè)計(jì)接種OM 真菌（＋M），接種體積為2 mL 和不接種OM 真菌（－M）兩個(gè)水平，硝酸鑭處理設(shè)置0、1．0、3．0、5．0和7．0mg·L－1等5個(gè)水平，組成10處理組合，每個(gè)組合處理重復(fù)3次。選生長(zhǎng)一致的鐵皮石斛組培苗（苗高3cm 左右）為原始試驗(yàn)材料，以盆栽的方式進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基以樹(shù)皮為主輔以小石子。栽種之前，培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行滅菌處理，然后接種菌根真菌，以不接種菌根真菌作為對(duì)照（－M），然后分別添加設(shè)計(jì)濃度的硝酸鑭進(jìn)行培養(yǎng)，每20d添加1次營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)時(shí)間從2013年4月至2013年9月，然后收獲測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1．3 菌根侵染情況測(cè)定

每組隨機(jī)抽取鮮根30條，參考Biermann等［13］描述的方法測(cè)定菌根的形成情況。將根段洗凈除去雜質(zhì)，用75%的乙醇擦拭表面，無(wú)菌水沖洗數(shù)次，于培養(yǎng)皿中用解剖刀將根切成2～4cm 長(zhǎng)的段，然后放入10%的KOH 溶液中，121℃充分脫色20min，再用無(wú)菌水沖洗3次。將沖洗好的材料放入苯胺藍(lán)溶液中染色4h（溫度90℃），然后用無(wú)菌水沖洗，除去表面的染液，再在堿性雙氧水中脫色8 min。最后調(diào)查菌根侵染率，脫色后根段中有藍(lán)色部分即表明真菌已成功侵染。

菌根侵染率（%）＝有菌根的根段數(shù)／根段總數(shù)×100%

1．4 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

將石斛鮮藥取出培養(yǎng)基，按根和莖葉分開(kāi)，分別稱取根部和地上部分的質(zhì)量。葉綠素含量采用丙酮酸混合液方法提取測(cè)定［14］；丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定［14］；可溶性蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法測(cè)定［14］；多糖含量采用苯酚硫酸法［15］測(cè)定。

取1g樣品加入20mL 磷酸鹽緩沖液，在冰浴中研磨，離心后，上清液用于保護(hù)酶活性測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性分別用SOD 和CAT 試劑盒測(cè)定，過(guò)氧化物酶（POD）活性用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，單位均為U·g－1［16］。

1．5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，每個(gè)水平重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值附標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 硝酸鑭對(duì)鐵皮石斛菌根侵染的影響

硝酸鑭對(duì)鐵皮石斛菌根的形成具有一定的促進(jìn)作用（表1）。隨著硝酸鑭濃度的增加，鐵皮石斛OM 真菌的侵染率也隨之提高，并當(dāng)硝酸鑭濃度達(dá)到5．0mg·L－1時(shí)，侵染率達(dá)到最高（92．8%），繼續(xù)增加硝酸鑭濃度OM 真菌的侵染率反而顯著降低，但仍顯著高于未添加硝酸鑭處理的侵染率（46．4%）；由于栽培基質(zhì)經(jīng)過(guò)滅菌處理，所以，未接種的各處理均未發(fā)現(xiàn)OM 真菌侵染。由此可見(jiàn)，適當(dāng)濃度的硝酸鑭有利于OM 真菌的侵染和石斛菌根的發(fā)育，過(guò)量的硝酸鑭會(huì)抑制石斛菌根的發(fā)育。

2．2 硝酸鑭和OM 真菌對(duì)鐵皮石斛生物量的影響

OM 真菌和硝酸鑭對(duì)鐵皮石斛生物量積累具有顯著的促進(jìn)作用，鐵皮石斛組培苗接菌和硝酸鑭處理后生長(zhǎng)比對(duì)照組旺盛，苗色濃綠，產(chǎn)生新根多。由表1可知，隨著硝酸鑭濃度的增大，接種（＋M）和未接種（－M）OM 真菌的鐵皮石斛根重、莖葉重和總生物量均呈先增后降的趨勢(shì)，尤其接種OM 真菌后，根重、莖葉重和總生物量均顯著增加（P＜0．05）；當(dāng)硝酸鑭濃度為5．0 mg·L－1時(shí)，接種OM真菌（＋M）的石斛根重、莖葉重和總生物量均達(dá)到最大，分別是未添加硝酸鑭以及未接種對(duì)照組（－M）的4．26倍、4．98倍和4．87倍，同時(shí)也與該處理最高的菌根侵染率相對(duì)應(yīng)。

2．3 硝酸鑭和OM 真菌對(duì)鐵皮石斛葉綠素含量的影響

葉綠素含量在一定程度上反映了植物光合性能強(qiáng)弱。從圖1可以看出，隨著硝酸鑭濃度的增加，接種（＋M）和未接種（－M）OM 真菌的鐵皮石斛的葉綠素含量均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，并均在硝酸鑭濃度為5．0mg·L－1時(shí)達(dá)到最高值，且與未添加硝酸鑭處理相比均顯著增加；在相同硝酸鑭濃度下，接種OM 真菌處理（＋M）始終高于未接種處理（－M）?？梢?jiàn)，接種OM 真菌能顯著促進(jìn)鐵皮石斛幼苗葉綠素含量提高，在接種OM 真菌同時(shí)再添加一定濃度的硝酸鑭又能顯著增強(qiáng)這種促進(jìn)作用，并當(dāng)硝酸鑭濃度為5．0mg·L－1時(shí)效果最佳。

2．4 硝酸鑭和OM 真菌對(duì)抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

CAT、POD 和SOD 是活性氧清除系統(tǒng)的重要抗氧化酶。由圖2 可知，同一硝酸鑭水平下，接種OM 真菌鐵皮石斛植株細(xì)胞內(nèi)CAT、POD 和SOD活性均高于未接種OM 真菌植株；鐵皮石斛幼苗CAT、POD和SOD活性對(duì)不同濃度的硝酸鑭處理的響應(yīng)特征是不同的，在0～3mg·L－1之間，CAT（圖2，A）和POD（圖2，B）活性隨硝酸鑭濃度增加而上升，之后又下降；而在0～5mg·L－1之間，SOD的活性隨硝酸鑭濃度增加而上升，之后又下降（圖2，C）。所以，在適量的硝酸鑭濃度下接種OM 真菌能夠提高鐵皮石斛幼苗保護(hù)酶活性，增強(qiáng)石斛的抗逆性，促進(jìn)石斛的生長(zhǎng)。

表1 硝酸鑭和OM 真菌處理下鐵皮石斛生物量Table 1 The biomass of D．officinale seedling with lanthanum nitrate and OM fungus treatments

圖1 硝酸鑭和OM 真菌處理下鐵皮石斛葉綠素含量變化Fig．1 The changes of chlorophyll content in D．officinale seedling with lanthanum nitrate and OM fungus treatments

丙二醛是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其積累是活性氧毒害作用的體現(xiàn)，由圖2，D可知，隨著硝酸鑭濃度的增加，接種（＋M）和未接種（－M）OM 真菌的鐵皮石斛的丙二醛含量均呈現(xiàn)先降低后上升的變化趨勢(shì)，并均在硝酸鑭濃度為5．0mg·L－1時(shí)達(dá)到最低值，且與未添加硝酸鑭處理相比顯著降低；在相同的硝酸鑭濃度下，接種OM 真菌處理（＋M）始終低于未接種處理（－M）?？梢?jiàn)，接種OM 真菌能顯著降低丙二醛含量，在接種OM 真菌同時(shí)再添加5．0 mg·L－1的硝酸鑭效果最佳。接種OM 真菌和使用適當(dāng)濃度的硝酸鑭降低了細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，有助于膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，從而提高了細(xì)胞的生理活性，促進(jìn)鐵皮石斛的生長(zhǎng)。

2．5 硝酸鑭和OM 真菌對(duì)多糖和可溶性蛋白含量的影響

多糖和蛋白質(zhì)是細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)多糖和蛋白質(zhì)含量體現(xiàn)了細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝水平。由圖3可知，隨著硝酸鑭濃度的增加，接種（＋M）和未接種（－M）OM 真菌的鐵皮石斛多糖和蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，并均在硝酸鑭濃度為5．0mg·L－1時(shí)達(dá)到最高值，且與未添加硝酸鑭相比顯著增加；在相同硝酸鑭濃度下，接種OM真菌處理（＋M）始終高于未接種處理（－M）?？梢?jiàn)，接種OM 真菌能顯著促進(jìn)鐵皮石斛多糖和蛋白質(zhì)的合成，在接種OM 真菌同時(shí)再添加一定濃度的硝酸鑭又能顯著增強(qiáng)這種促進(jìn)作用，并當(dāng)硝酸鑭濃度為5．0mg·L－1時(shí)效果最好。

圖2 硝酸鑭和OM 真菌處理下鐵皮石斛CAT、POD、SOD 活性和MDA 含量變化Fig．2 The changes of CAT，POD and SOD activities and MDA content in D．officinale seedling with lanthanum nitrate and OM fungus treatments

圖3 硝酸鑭和OM 真菌處理下鐵皮石斛多糖和蛋白質(zhì)含量變化Fig．3 The changes of polysaccharide and protein contents in D．officinale seedling with lanthanum nitrate and OM fungus treatments

3 討 論

真菌成功浸染是產(chǎn)生菌根效應(yīng)的基礎(chǔ)，石斛菌根的形成與其根際微生物有關(guān)，適宜的根際微生態(tài)環(huán)境有利于菌根的形成，如土壤中施氮量能顯著影響AM 菌根的形成［17］。菌根真菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵染與菌根真菌的生理活性有關(guān)［18］。稀土元素具有重要的生理功能，可以提高微生物的活性［19］，促進(jìn)石斛菌根的形成。本研究表明，稀土鑭不僅能促進(jìn)鐵皮石斛的生長(zhǎng)，也能提高根際微生物活性；添加適量的硝酸鑭能促進(jìn)接種OM 真菌對(duì)石斛根系的侵染能力，有利于鐵皮石斛菌根的形成，從而使鐵皮石斛生長(zhǎng)比較旺盛，苗色濃綠，產(chǎn)生新根多，生物量明顯高于對(duì)照組。接種OM 真菌提高了石斛的生長(zhǎng)量，可能是菌根的形成擴(kuò)大了石斛根系的吸收范圍，從而使石斛能吸收更多的營(yíng)養(yǎng)以供生長(zhǎng)。同時(shí)，葉綠素是植物光合作用的基礎(chǔ)色素［20］，植物通過(guò)葉綠素對(duì)光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行光合作用。石斛菌根的形成提高了石斛葉片的葉綠素含量，改變了植物的生長(zhǎng)特性，這也可能是接種OM 真菌提高石斛生長(zhǎng)量的原因之一。另外，糖和蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，細(xì)胞內(nèi)糖類和蛋白質(zhì)的含量體現(xiàn)了細(xì)胞的生理活性，可溶性蛋白質(zhì)含量的提高能增強(qiáng)植物的光合能力。菌根的形成有助于碳代謝，提高細(xì)胞生理活性和植物適應(yīng)能力［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，接種OM 真菌同時(shí)添加硝酸鑭提高了細(xì)胞內(nèi)多糖和蛋白質(zhì)含量，促進(jìn)了鐵皮石斛中物質(zhì)的積累，這是石斛植株生物量增加的另一個(gè)因素。

植物的抗逆性與防御系統(tǒng)活性密切相關(guān)，硝酸鑭和OM 真菌能提高細(xì)胞生理活性，細(xì)胞代謝旺盛，而它們的聯(lián)合使用效果更顯著。有氧呼吸產(chǎn)生了大量的活性氧，加速了氧化脅迫。植物體內(nèi)存在SOD、CAT 和POD 等活性氧清除酶系統(tǒng)，這些酶協(xié)同作用使活性氧產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，以維持植物的正常生理代謝［22］。同時(shí)，POD 是多功能酶，對(duì)植物生長(zhǎng)還具有調(diào)節(jié)作用。MDA 是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量高低可以反映植物遭受逆境傷害程度。大量活性氧的產(chǎn)生加速了氧化脅迫，促進(jìn)了細(xì)胞膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量MDA。MDA 的積累與保護(hù)酶的活性有一定的相關(guān)性，保護(hù)酶活性的提高有利于降低MDA 的含量。本研究中，適量的硝酸鑭和OM 真菌均能提高細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶的活性，降低MDA 的含量，二者的變化呈現(xiàn)一定的相關(guān)性；在同一硝酸鑭水平下，接種OM 真菌的植株細(xì)胞內(nèi)的SOD、CAT 和POD 活性均高于未接種處理，可見(jiàn)，接種OM 真菌再添加適量的硝酸鑭效果更佳。適量的硝酸鑭和OM 真菌的聯(lián)合使用能有效防止植株衰老，提高植株的抗逆性和適應(yīng)性，促進(jìn)鐵皮石斛的生長(zhǎng)。

總之，添加適量的硝酸鑭和接種OM 真菌能明顯改善鐵皮石斛生理特性，適量的硝酸鑭能促進(jìn)鐵皮石斛菌根的形成，進(jìn)而提高鐵皮石斛的葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量以及保護(hù)酶活性，降低MDA含量，增強(qiáng)了鐵皮石斛對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，提高鐵皮石斛生物量和多糖等活性成分的積累。本研究結(jié)果為今后進(jìn)一步開(kāi)展石斛菌根化栽培和稀土菌肥的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

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